Summary
该协议描述了一种简单的过程,该过程利用方便的塑料微模具进行简单的微压花操作,以在纳米纤维化纤维素纸上制造微通道,实现最小宽度为200μm。
Abstract
纳米纸源自纳米纤维化纤维素,作为一种有前途的微流体应用材料,已经引起了人们的极大兴趣。它的吸引力在于一系列卓越的品质,包括异常光滑的表面、出色的光学透明度、具有纳米级孔隙率的均匀纳米纤维基质以及可定制的化学特性。尽管基于纳米纸的微流控技术发展迅速,但目前用于在纳米纸上创建微通道的技术,如3D打印、喷涂或手动切割和组装,对实际应用至关重要,但仍具有一定的局限性,特别是对污染的敏感性。此外,这些方法仅限于毫米级通道的生产。本研究介绍了一种简单的工艺,利用方便的塑料微模具进行简单的微压花操作,在纳米纸上制造微通道,实现最小宽度 200 μm。所开发的微通道优于现有方法,实现了四倍的改进,并且可以在 45 分钟内完成。此外,还优化了制造参数,并为应用程序开发人员提供了方便的快速参考表。演示了层流混合器、液滴发生器和基于纳米纸的功能性分析设备 (NanoPAD) 的概念验证,这些设备设计用于使用表面增强拉曼光谱进行罗丹明 B 传感。值得注意的是,NanoPAD表现出卓越的性能和改进的检测限。这些出色的结果可归因于纳米纸的卓越光学性能和最近开发的精确微压花方法,使NanoPAD的集成和微调成为可能。
Introduction
最近,纳米纤维化纤维素 (NFC) 纸(纳米纸)已成为一种非常有前途的基板材料,可用于柔性电子、能源器件和生物医学等各种应用 1,2,3,4。纳米纸来源于天然植物,具有成本效益、生物相容性和可生物降解性,使其成为传统纤维素纸的有吸引力的替代品5,6。其特殊性能包括表面粗糙度小于 25 nm 的超光滑表面和致密的纤维素基质结构,允许创建高度结构化的纳米结构7。纳米纸中丰富的羟基有助于其紧凑和紧密堆积的纳米纤维素结构8.纳米纸具有出色的光学透明度和最小的光学雾度,非常适合光学传感器。此外,其固有的亲水性使无泵流动,即使其结构较厚,也能提供自主流体运动9,10。纳米纤维素在生物传感器、导电电子设备、细胞培养平台、超级电容器、电池等方面具有多种应用,展示了其多功能性和潜力11,12。特别是,纳米纤维素在纸基分析微流控装置(μPAD)中很有前途,与传统的色谱纸相比具有独特的优势。
在过去十年中,μPAD因其经济实惠、生物相容性、无泵操作和易于生产而受到广泛关注13,14。这些设备已成为有效的即时诊断工具,特别是在资源有限的环境中15,16,17。该领域的一项重大进步是由George Whitesides18和Bingcheng Lin小组19率先开发的蜡印刷,通过在色谱纸上加入微通道来创建功能性μPAD。随后,μPADs迅速发展,各种生物传感技术,包括电化学方法20、化学发光21和酶联免疫吸附测定(ELISA)22、23、24,成功用于检测各种生物标志物,如蛋白质25,26、DNA、27,28、RNAs29,30和蛋白质25,26、DNA、27,28、RNAs29,30和外泌体31.尽管取得了这些成就,μPAD仍然面临挑战,包括流速慢和溶剂蒸发。
已经提出了几种在纳米纸32,33,34上创建微通道的方法。一种方法涉及将牺牲成分 3D 打印到材料中,但它需要疏水涂层来限制无泵操作33。另一种技术涉及使用胶水在纳米纸之间手动堆叠通道层,这是劳动密集型的32。或者,将纳米纤维素纤维喷涂到预图案化的模具上可以产生微通道,但它涉及耗时且昂贵的模具制备34。值得注意的是,这些方法仅限于毫米级微通道,损害了微流控设备在试剂体积消耗和集成度方面的优势。开发具有微米级分辨率的简单纳米纸微通道图案化工艺仍然是一个挑战。
本研究提出了一种基于实际微压花的独特纳米纸微通道图案化方法。与现有方法相比,该方法具有多项优势,因为它不需要昂贵或专门的设备,简单、经济高效且高度准确。凸微通道模具是通过激光切割聚四氟乙烯 (PTFE) 薄膜制成的,聚四氟乙烯 (PTFE) 薄膜以其化学惰性和不粘特性而闻名。然后使用该模具将微通道压印到纳米纸凝胶膜上。在顶部涂上第二层纳米纸凝胶以形成封闭的空心通道。使用这种图案化技术,开发了纳米纸上的基本微流控设备,包括层流混合器和液滴发生器。此外,还演示了表面增强拉曼显微镜(SERS)NanoPAD的制备。通过在通道中引入两种化学试剂(AgNO3 和 NaBH4),实现了基于银纳米颗粒的 SERS 底物的原位制备,从而在低检测限 (LOD) 下获得了卓越的性能。
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Protocol
1. 纳米纸微通道图案的微压花工艺
- 模具准备
注:有关模具制备的详细信息,请参阅 Yuan 等人 12 。- 按照 材料表中的指示准备PTFE薄膜。
- 激光切割准备好的PTFE薄膜以制作凸微通道模具(图1A-I)。
注意:PTFE模具的尺寸决定了线性一阶函数关系中的微通道尺寸(图2E,F)。
- 纳米纸制备
- 将4.0g(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)氧化的NFC凝胶(见 材料表)分散在蒸馏水中(终浓度为0.1wt%)。
- 在室温下以120.8× g 充分搅拌悬浮液30分钟,直到看不到纤维素絮凝体。
- 对透明悬浮液进行真空过滤以获得纳米纸凝胶(图1A-II)。
注:在本例中,获得的纳米纸凝胶的直径为4厘米。通过选择不同半径的抽滤装置,可以针对各种应用定制NanoPAD,从而实现不同规模的NanoPAD设计。
- 纳米纸凝胶压花
- 将PTFE模具放在纳米纸凝胶的表面上。
- 在优化的压力和温度下,使用PTFE模具通过热压机压印纳米纸凝胶(图1A-III)每次10分钟(图2A-D)。
注意:更高的压花压力(250 kPa 至 1000 kPa)可提高制造精度,但不应超过 1000 kPa,以防止损坏纤维素结构。较高的压花温度(25-100°C)通过促进脱水和脱碳来提高微通道的准确性,但温度不应超过75°C,以避免凝胶起皱和降低透光率7。在本例中,优化的压花参数为 750 kPa 和 75 °C。
- 脱模剂
- 从滤膜上剥下一层过滤纳米纸凝胶(图1A-IV)。
- 粘 接
- 将剥离的层附着在纳米纸凝胶的压花层顶部,将两层堆叠在一起以形成中空微通道结构(图1A-V)。
注意:与纤维悬浮液和干燥纳米纸相比,“凝胶状”纳米纸中的氢键更强,增强了纳米纤维素纤维的缠结和粘附。因此,两层“凝胶状”纳米纸可以在没有外力的情况下通过自扩散紧密结合。
- 将剥离的层附着在纳米纸凝胶的压花层顶部,将两层堆叠在一起以形成中空微通道结构(图1A-V)。
- 干燥
- 将两层纳米纸凝胶置于75°C的干燥箱中约30分钟(图1A-VI)。
2. 基础微流控装置的构建
- 层流混合机的构造
- 按照步骤1准备具有直线和弯曲通道的NanoPAD(图3A)。
注意:在本例中,通道的尺寸为 1 mm 宽和 50 μm 深度。 - 同时在入口区域添加红色和蓝色液滴,允许流动自动通过空心通道。
注:红色和蓝色溶液在直通道中的成功独立流动及其在弯曲通道末端的混合可归因于微流体装置中层的低雷诺数和剪切应力引起的径向流动35。
- 按照步骤1准备具有直线和弯曲通道的NanoPAD(图3A)。
- 液滴发生器的构造
- 根据步骤1准备具有T型连接通道的双入口NanoPAD(图3D)。
- 将水和十六烷(油)这两种不混溶的液体引入T型连接通道的两个入口区域以产生液滴(图3E)。
注意:在本例中,T 型结通道的尺寸为 1 mm 宽、25 mm 长和 50 μm 深。 - 将 Q1 的速度固定为 6 μL/min,将 Q2 的速度固定在 n × Q 1 (n =1-6 )。使用两个注射泵并将它们设置为上述速度以注入水和油。此行为由一个简单的缩放方程(如下所示)控制。
注意:在本例中,将油和有色水倒入通道36。
其中 α = 1,β = 1,L 是液滴的长度,W 是液滴的宽度,Q1 和 Q2 分别是水和十六烷的流速37,38。
3. 原位 AgNP生长
- NanoPADs制备
- 根据步骤1制备具有会聚检测区的双入口NanoPAD(图4A)。
- 连续离子层吸附和反应过程
- 制备 20 mM AgNO3 溶液和 20 mM NaBH4 溶液(参见 材料表)。
- 将 5 μL 的 20 mM AgNO3 溶液滴入流道的左侧入口区。
- 让 AgNO3 溶液在反应区停留 30 秒。
注意:重复步骤 3.2.2。和 3.2.3.五次保证AgNPs均匀分布而不结聚,这可以解释较高的能带强度。 - 将 5 μL 蒸馏水滴入流道的左侧入口区域进行冲洗。
注意:重复步骤 3.2.4。三次,以确保通过洗涤去除过多的、未吸附的 Ag 离子。 - 将 5 μL 的 20 mM NaBH4 溶液加入流道的右侧入口区域。
注意:重复步骤 3.2.5。直到AgNPs在反应区均匀生成。步骤3中涉及的化学反应由以下式39表示:
在本例中,在NanoPAD上形成了致密、均匀、结构良好的AgNP阵列(图4B)。AgNPs的平均直径为55nm(图4C)。
4. SERS测量
- 拉曼光谱系统制备
- 打开激光器并启动拉曼光谱仪的随附软件(参见 材料表)。
- 使用 50 倍物镜聚焦和收集拉曼信号,使用 532 nm 激光进行激发。
- 将光谱分辨率设置为 2 cm-1 以实现准确测量。将拉曼光谱测量范围设置为 400 cm-1 至 600 cm-1。
- 使用硅晶圆校准拉曼光谱仪12.
注意:执行步骤 4.1。对于步骤 4.2。
- 罗丹明 B (RhB) 测量
- 将 4.7 mg RhB(参见 材料表)溶解在 10 mL 乙醇中,制备 1 mM RhB 溶液。
- 通过在乙醇中稀释 1 mM RhB 溶液,制备一系列浓度范围为 10 μM 至 0.1 pM 的 RhB 溶液。
- 将 5 μL RhB 溶液加入 NanoPADs 通道的入口区域并使其干燥。
注意:重复步骤 4.2.3。用于步骤4.2.2中指示的不同浓度的RhB溶液。 - 将激励时间设置为 10 s,将光栅设置为 2 cm−1,将周期数设置为 1。设置拉曼光谱测量范围从 500 cm-1 到 1800 cm−1。
- 分别调整粗调焦螺钉和精调焦螺钉以达到正确的对焦,然后单击 停止 以保存位置。
- 单击“开始” 开始 测量。
- 重复测量七次并保存收集的数据。
- 关闭激光。
- 数据分析
- 将保存的数据导入数据分析软件(参见 材料表)。
- 根据保存的数据计算平均频谱。
- 选择绘制拉曼光谱的 线草 图选项。
- 利用 峰值分析仪 工具设置谱图的基线。
- 应用 信号过程 - 平滑功能来平滑光谱以获得最终结果。
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Representative Results
通过方便的微压花技术,利用实用的塑料微模具,设计了一种在纳米纸上创建微通道图案的独特方法。值得注意的是,该方法在小至200μm的尺度上实现了微通道图案化,与现有方法相比,这代表了四倍的改进32,33,34。在对图案参数进行微调后,所提供的指南在制造过程中表现出出色的可重复性,其特点是标准偏差最小。观察到的最高宽度变化仅为2.5%,而深度则为9%。此外,还包括图 2E,F 作为应用程序开发的指南。
为了展示所开发的SERS-NanoPADs的实际应用,以罗丹明B(RhB)为例,罗丹明B是一种常见的环境污染物和低毒有机化学品。将RhB分子直接与乙醇混合。在本例中,将 5 μL 分析物溶液填充到 NanoPAD 的入口区,然后测量反应区中的拉曼信号。不同浓度的乙醇(范围从0.1 pM到10 μM)的RhB样品的拉曼光谱如图5A所示,使用纯乙醇作为空白对照。在测量的光谱中观察到清晰的RhB条带,包括C-O-C拉伸(1280 cm-1)、氧杂蒽环褶皱模式(1200 cm-1)、C-N拉伸(1384 cm-1)、C-C拉伸(1350 cm-1)、C-H拉伸(1520 cm-1)和芳香族C-C拉伸(1646 cm-1)40,41。由于 1646 cm-1 峰强度对 RhB 浓度的敏感性和最小的背景噪声,因此选择它作为读数参数42。检测限 (LOD) 的计算涉及确定对应于空白对照强度加上空白对照拉曼强度标准偏差三倍的 RhB 浓度。该计算得出的LOD为0.019 pM。图5B显示了RhB检测的校准曲线。
图 1:用于在纳米纸上图案化微通道的微压花工艺示意图 。 (A) 微压花工艺包括六个步骤:模具制备、纳米纸过滤、压花、脱模、粘合和最终干燥。(B)微压花工艺的横截面图。该图经 Yuan 等人许可转载。版权所有 2023 美国化学学会12. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:微通道压花优化。 宽度和深度的制造精度分别受(A,B)压花压力和(C,D)干燥温度的影响。纳米纸微流控器件中(E)通道宽度和(F)深度的设计要求(n = 5)。(目标:预期的微通道的宽度和深度;获得的:制造的微通道的宽度和深度;设计:PTFE模具的宽度和深度)。该图经 Yuan 等人许可转载。版权所有 2023 美国化学学会12. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:纳米纸微通道中流体行为的基本原理 。 (A)纳米纸微流控混合器和层流装置的照片。比例尺 = 5 mm。 (B) 沿空心通道在不同距离处的吸流。比例尺 = 2 mm。 (C) 沿空心通道的毛细管性能 (n=5)。(D) T型连接通道内的液滴和带有入口管的压花装置的示意图。(E) 在不同频率下工作的液滴发生器。比例尺 = 5 mm。 (F) 对 Q1/Q2 和 L/W 流量的线性依赖性 (n = 5)。该图经 Yuan 等人许可转载。版权所有 2023 美国化学学会12. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:NanoPAD 上小分子的灵敏 SERS 传感 。 (A) NanoPAD检测区上AgNP生长示意图。(B) AgNPs生长后的NanoPADs照片和基于SERS的分子检测示意图。比例尺 = 1 cm。 (C) NanoPAD上 原位 生长的AgNPs的SEM图像显示了密集且有组织的AgNPs阵列。比例尺 = 500 nm;插图 = 100 nm。该图经 Yuan 等人许可转载。版权所有 2023 美国化学学会12. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:基于 SERS 的 RhB 检测。 (A) 浓度为 0.1 pM 至 10 μM 的 RhB 拉曼光谱。 (B) 在 1646 cm-1 处校准 RhB (n=5)。该图经 Yuan 等人许可转载。版权所有 2023 美国化学学会12. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本研究的主要重点是开发一种在纳米纸上制造微通道的简单方法。设计了一种使用 PTFE 作为模具的高效压花技术来应对这一挑战12.通过优化温度和压花压力,进行了一系列实验,建立了可靠的NanoPAD制造工艺。此外,还演示了使用快速参考表来调整NanoPADs在不同领域的应用。虽然这种方法高效稳定,但也遇到了一些挑战。最初,金属因其光滑性而被用作模具,但在将它们从粘合剂纳米纸凝胶中去除时出现了困难。最终,PTFE因其不粘特性和在压花工艺中的易操作性而被选中。解决的另一个挑战是空心通道的制造。“凝胶状”纳米纸8 中的强氢键允许两层的自扩散和粘附,从而在没有外力的情况下实现紧密键合。
虽然所开发的方法简单、省时,并且在纳米纸上制造无泵微通道时最大限度地减少了污染,但仍然存在局限性。激光切割的精度将 PTFE 模具的宽度限制在 200 μm,从而将微通道的可实现精度限制在 200 μm。为了克服这一限制,计划在未来的努力中实施用于3D打印模具的纳米打印机,利用其能力实现50μm的精度。另一个需要进一步改进的领域是3D微通道的制造。虽然 3D 微通道33,34 已广泛用于使用 PDMS 和常规纸基设备等材料的生物医学、化学和电气检测,但在纳米纸上制造 3D 微通道仍然是一个新兴领域。解决这一挑战将极大地促进NanoPAD的发展。
本研究的重点是使用分子作为拉曼报告基因进行SERS检测。SERS 技术42 具有许多优点,包括试剂使用量少、选择性高、样品制备简单和出色的稳定性,使其成为生化检测的关键方法。所设计的NanoPAD在SERS免疫测定中具有潜在的应用。此外,人们对选择性和定制的SERS等离子体的兴趣日益浓厚。探索在NanoPAD上产生这些等离子体的方法,用于选择性SERS检测,为纳米纸领域的未来发展提供了一条令人兴奋的途径。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢江苏省高等学校自然科学基金(22KJB460033)和江苏省科技计划-青年学者(BK20200251)项目的资助。这项工作还得到了西交利物浦大学人工智能大学研究中心、西交利物浦大学江苏省数据科学与认知计算工程研究中心和SIP AI创新平台(YZCXPT2022103)的部分支持。还感谢制造系统工程国家重点实验室通过开放项目(SKLMS2023019)和仿生工程教育部重点实验室的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AgNO3 | Hushi (Shanghai, China) | 7761-88-8 | >99% |
Ethanol | Hushi (Shanghai, China) | 64-17-5 | >99% |
Hexadecane | Macklin (Shanghai, China) | 544-76-3 | >99% |
LabSpec software | Horiba (Japan) | LabSpec5 | |
Melamine | Macklin (Shanghai, China) | 108-78-1 | >99% |
NaBH4 | Aladdin (Shanghai, China) | 16940-66-2 | >99% |
Origin lab software | OriginLab (USA) | ||
Polyethylene terephthalate (PET) | Myers Industries (Akron, USA) | ||
Polytetrafluoroethylene films | Shenzhen Huashenglong plastic material Co., Ltd. (Shenzhen, China) | Teflon film | |
PVDF filter membrane | EMD Millipore Corporation (USA) | VVLP04700 | pore size: 0.1 μm |
Raman spectrometer | Horiba (Japan) | Xplo RA | |
Rhodamine B | Macklin (Shanghai, China) | 81-88-9 | >95% |
Scanning electron microscopy (SEM) | FEI(USA) | Scios 2 HiVac | |
Silicon wafer | Horiba (Japan) | diameter: 5 mm | |
TEMPO-oxidized NFC slurry | Tianjin University of Science and Technology | 1.0 wt% solid, carboxylate level 2.0 mmol/g solid, average nanofiber diameter: 10 nm |
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