Une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris
Summary
Cette étude présente un ensemble de méthodes simples et faciles à utiliser pour marquer et analyser les glomérules des reins de souris nettoyés par CUBIC. Des données telles que le nombre et le volume du glomérule peuvent être obtenues facilement et de manière fiable à l’aide de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-Dextran, de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) ou de la microscopie confocale commune et de logiciels tels qu’Imaris.
Abstract
Les glomérules sont des unités fondamentales dans le rein ; Par conséquent, l’étude des glomérules est essentielle pour comprendre la fonction rénale et la pathologie. L’imagerie biologique fournit des informations intuitives ; Il est donc d’une grande importance d’étiqueter et d’observer les glomérules. Cependant, les méthodes d’observation des glomérules actuellement utilisées nécessitent des opérations compliquées, et les résultats peuvent perdre des détails d’étiquette ou des informations tridimensionnelles (3D). La technologie d’élimination des tissus (CUBIC) a été largement utilisée dans la recherche rénale, permettant une détection plus précise et une profondeur de détection plus profonde. Nous avons constaté que les glomérules de souris peuvent être marqués rapidement et efficacement par injection dans la veine caudale de FITC-Dextran de poids moléculaire moyen, suivie de la méthode de nettoyage CUBIC. Le rein de souris nettoyé pourrait être scanné par un microscope à feuille de lumière (ou un microscope confocal lorsqu’il est tranché) pour obtenir des empilements d’images tridimensionnelles de tous les glomérules dans l’ensemble du rein. Traités à l’aide d’un logiciel approprié, les signaux des glomérules pourraient être facilement numérisés et analysés pour mesurer le nombre, le volume et la fréquence des glomérules.
Introduction
Le nombre et le volume des glomérules sont très importants pour le diagnostic et le traitement de diverses maladies rénales 1,2,3,4,5. L’étalon-or de l’estimation du nombre de glomérules est la combinaison dissecteur/fractionneur physique. Cependant, cette méthode nécessite des réactifs et des équipements spéciaux, ce qui la rend lente et coûteuse 6,7,8,9. La biopsie fournit une mine d’informations, mais il est évident que cette méthode ne convient qu’à des estimations approximatives10,11. Les technologies d’imagerie médicale, y compris l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (TDM) et les rayons X, sont également largement utilisées dans la détection glomérulaire 12,13,14,15, mais ces technologies nécessitent des instruments encombrants. De nouvelles méthodes, telles que le spectromètre de masse imageur par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)16 ou la méthode des sections épaisses et minces17, ont également été utilisées pour la détection glomérulaire, bien qu’elles restent fastidieuses et laborieuses.
À l’aide des technologies de transparence, il est possible d’observer des profondeurs plus profondes et d’obtenir des informations plus riches et plus complètes à partir de tissus épais ou même d’organes entiers 18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les technologies de transparence ont été largement utilisées dans la recherche sur les reins24. L’observation et la détection des glomérules dans les reins dégagés sont également impliquées. Cependant, ces articles publiés ne faisaient que brièvement référence à la détection glomérulaire25 ou utilisaient des méthodes de marquage difficiles à réaliser telles que des animaux transgéniques26, des colorants autoproduits13 ou l’incubation d’anticorps à haute concentration27 pour marquer les glomérules. De plus, bien que des études aient analysé des glomérules dans des reins dégagés, les analyses étaient toujours limitées13 ou reposaient sur des algorithmes d’analyse établis par les auteurs eux-mêmes26.
Nous avons déjà démontré un moyen plus pratique d’étiqueter les glomérules dans les reins de souris28. En utilisant Imaris, nous avons constaté que le nombre, la fréquence et le volume des glomérules pouvaient être obtenus rapidement. Ainsi, nous présentons ici un ensemble de méthodes plus accessibles, complètes et simplifiées pour étiqueter et analyser les glomérules des reins de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les technologies de nettoyage des tissus peuvent être classées en 3 ou 4 groupes 29,30,31. L’élimination des tissus à base de solvants organiques (p. ex., DISCO et PEGASOS), l’élimination des tissus à base d’eau (p. ex., CUBIC) et l’élimination des tissus d’enrobage d’hydrogel (p. ex., CLARITY) ont toutes été appliquées dans le nettoyage des reins 25,26,28,32.<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82204951) et du Programme des sciences et technologies du Sichuan (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
