Un método eficiente y rápido para etiquetar y analizar glomérulos de ratón
Summary
Este estudio presenta un conjunto de métodos fáciles de usar, completos y simples para etiquetar y analizar glomérulos de riñones de ratón aclarados por CUBIC. Los datos como el número y el volumen del glomérulo se pueden obtener de forma fácil y fiable utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextrano, microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) o microscopía confocal común y software como Imaris.
Abstract
Los glomérulos son unidades fundamentales en el riñón; Por lo tanto, el estudio de los glomérulos es fundamental para comprender la función renal y la patología. Las imágenes biológicas proporcionan información intuitiva; Por lo tanto, es de gran importancia etiquetar y observar los glomérulos. Sin embargo, los métodos de observación de glomérulos que se utilizan actualmente requieren operaciones complicadas y los resultados pueden perder detalles de la etiqueta o información tridimensional (3D). La tecnología de limpieza de tejidos de análisis computacional (CUBIC) y cócteles de imágenes cerebrales transparentes y sin obstrucciones se ha utilizado ampliamente en la investigación renal, lo que permite una detección más precisa y una profundidad de detección más profunda. Descubrimos que los glomérulos de ratón pueden marcarse rápida y eficazmente mediante la inyección en la vena de la cola de FITC-Dextrano de peso molecular medio, seguida del método de aclaramiento CUBIC. El riñón de ratón aclarado podría escanearse con un microscopio de lámina de luz (o un microscopio confocal cuando se corta) para obtener pilas de imágenes tridimensionales de todos los glomérulos de todo el riñón. Procesadas con el software adecuado, las señales de los glomérulos podrían digitalizarse fácilmente y analizarse más a fondo para medir el número, el volumen y la frecuencia de los glomérulos.
Introduction
El número y el volumen de los glomérulos son muy importantes para el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades renales 1,2,3,4,5. El estándar de oro de la estimación del número de glomérulos es la combinación física de disector/fraccionador. Sin embargo, este método requiere reactivos y equipos especiales, lo que lo hace lento y costoso 6,7,8,9. La biopsia proporciona una gran cantidad de información, pero obviamente, este método solo es adecuado para estimaciones aproximadas10,11. Las tecnologías de imágenes médicas, como la resonancia magnética (RM), la tomografía computarizada (TC) y los rayos X, también se utilizan ampliamente en la detección glomerular 12,13,14,15, pero estas tecnologías requieren instrumentos voluminosos. También se han utilizado nuevos métodos, como el espectrómetro de masas de imágenes de imágenes por láser asistido por matriz (MALDI)16 o el método de sección gruesa y delgada17, en la detección glomerular, aunque siguen siendo tediosos y laboriosos.
Con la ayuda de las tecnologías de transparencia, es posible observar profundidades más profundas y obtener información más rica y completa de tejidos gruesos o incluso de órganos enteros 18,19,20,21,22,23. Por lo tanto, las tecnologías de transparencia han sido ampliamente utilizadas en la investigación renal24. También está implicada la observación y detección de glomérulos en los riñones aclarados. Sin embargo, estos artículos publicados solo se refirieron brevemente a la detección glomerular25 o utilizaron métodos de etiquetado difíciles de lograr, como animales transgénicos26, colorantes autoproducidos13 o incubación de anticuerpos de alta concentración27 para etiquetar los glomérulos. Además, a pesar de que los estudios habían analizado glomérulos en riñones aclarados, los análisis siempre fueron limitados13 o se basaron en algoritmos de análisis establecidos por los propios autores26.
Anteriormente hemos demostrado una forma más conveniente de etiquetar los glomérulos en riñones de ratones28. Mediante el uso de Imaris, descubrimos que el recuento, la frecuencia y el volumen de los glomérulos se podían obtener rápidamente. Por lo tanto, aquí presentamos un conjunto de métodos más accesibles, completos y simplificados para etiquetar y analizar los glomérulos de los riñones de ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las tecnologías de limpieza de tejidos se pueden clasificar en 3 o 4 grupos 29,30,31. En la limpieza de los riñones se ha aplicado la limpieza de tejidos a base de disolventes orgánicos (p. ej., DISCO y PEGASOS), la limpieza de tejidos a base de agua (p. ej., CUBIC) y la limpieza de tejidos con incrustación de hidrogel (p. ej., CLARITY) 25,26,28,32.<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204951) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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