Summary
Denne protokol skitserer brugen af en specialdesignet optageenhed og elektroder til at registrere lokale feltpotentialer og undersøge informationsstrømmen i musens hippocampus og præfrontale cortex.
Abstract
Teknikken til registrering af lokale feltpotentialer (LFP'er) er en elektrofysiologisk metode, der anvendes til at måle den elektriske aktivitet af lokaliserede neuronale populationer. Det tjener som et afgørende redskab i kognitiv forskning, især i hjerneområder som hippocampus og præfrontale cortex. Dobbelte LFP-optagelser mellem disse områder er af særlig interesse, da de gør det muligt at udforske interregional signalkommunikation. Imidlertid beskrives metoder til udførelse af disse optagelser sjældent, og de fleste kommercielle optageenheder er enten dyre eller mangler tilpasningsevne til at imødekomme specifikke eksperimentelle designs. Denne undersøgelse præsenterer en omfattende protokol til udførelse af dobbeltelektrode LFP-optagelser i musens hippocampus og den præfrontale cortex for at undersøge virkningerne af antipsykotiske lægemidler og kaliumkanalmodulatorer på LFP-egenskaber i disse områder. Teknikken muliggør måling af LFP-egenskaber, herunder effektspektre inden for hvert hjerneområde og sammenhæng mellem de to. Derudover er der udviklet en billig, specialdesignet optageenhed til disse eksperimenter. Sammenfattende giver denne protokol et middel til at optage signaler med høje signal-støj-forhold i forskellige hjerneområder, hvilket letter undersøgelsen af interregional informationskommunikation i hjernen.
Introduction
Lokale feltpotentialer (LFP'er) henviser til den elektriske aktivitet registreret fra det ekstracellulære rum, hvilket afspejler den kollektive aktivitet af en lokaliseret gruppe neuroner. De udviser en bred vifte af frekvenser, der spænder fra langsomme bølger ved 1 Hz til hurtige svingninger ved 100 Hz eller 200 Hz. Specifikke frekvensbånd er blevet forbundet med kognitive funktioner såsom læring, hukommelse og beslutningstagning 1,2. Ændringer i LFP-egenskaber er blevet anvendt som biomarkører for forskellige neurologiske lidelser, herunder demens og skizofreni 3,4. Analyse af LFP-optagelser kan give værdifuld indsigt i de underliggende patologiske mekanismer forbundet med disse tilstande og potentielle terapeutiske strategier.
Dobbelt LFP-optagelse er en teknik, der bruges til at måle lokaliseret elektrisk aktivitet inden for og mellem to specifikke hjerneområder. Denne teknik giver en værdifuld mulighed for at undersøge den indviklede neurale dynamik og signalkommunikation, der forekommer inden for og mellem forskellige hjerneområder. Tidligere undersøgelser har vist, at detektion af ændringer i neuronale egenskaber i individuelle hjerneområder kan være komplekst, men ændringer i interregional kortikal kommunikation kan observeres 5,6. Derfor tilbyder brugen af dobbelt LFP-optagelse et potent middel til at løse dette problem.
Hippocampal-præfrontal forbindelse spiller en afgørende rolle i modulering af kognitive funktioner, og dysfunktion har været forbundet med forskellige neurologiske lidelser 7,8. Dobbeltelektrodeoptagelser af disse regioner kan give information om disse interaktioner. Desværre er der begrænset information tilgængelig om metoder til udførelse af dobbeltelektrode LFP-optagelser mellem disse områder. Desuden er kommercielt tilgængelige optageapparater generelt dyre og mangler tilpasningsevne til specifikke eksperimentelle design. Den konventionelle metode til registrering af LFP'er indebærer at bruge et afskærmet kabel til at forbinde optageenheden til elektroder implanteret i et dyrs hjerne. Denne tilgang er imidlertid modtagelig for bevægelsesartefakter og miljøstøj, hvilket påvirker kvaliteten og pålideligheden af de optagede signaler.
Denne protokol beskriver en omfattende procedure til udførelse af dobbeltelektrode LFP-optagelser i musens hippocampus og præfrontale cortex ved hjælp af et billigt specialdesignet hovedscene, der kan placeres på dyrets hoved. Disse metoder gør det muligt for forskere at undersøge regionsspecifikke oscillerende mønstre inden for to diskrete cerebrale regioner og udforske interregional informationsudveksling og forbindelse mellem disse områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Florey Animal Ethics Committee (University of Melbourne, nr. 22-025UM) i overensstemmelse med den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål. C57BL/6 hanmus (8 uger), opnået fra Animal Resources Centre (Australien), blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Headstage design og fabrikation
BEMÆRK: PCB-kortet på hovedscenen er et kompakt 14 mm x 12 mm firelagsbræt designet til at blive placeret direkte på dyrets hoved. Den bruger en kommerciel forstærkerchip (se materialetabel), og alle design- og Gerber-filer er tilgængelige online (GitHub-link: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Giv følgende specifikationer til producenten: Korttykkelse: 0,6 mm; Minimum sporing / afstand: 4 mils; Mindste hulstørrelse: 0,2 mm.
- Under PCB-samlingsprocessen, følg denne rækkefølge:
- Lod forstærkerchippen på tavlen ved hjælp af en varmluftpistol indstillet til 350 °C.
- Lod de passive komponenter.
- Lod SPI-stikket og elektrodekonnektoren (se materialetabellen).
- Undersøg lodningen under et mikroskop for kvalitetssikring. Fastgør SPI-stikket på plads ved hjælp af epoxy for ekstra stabilitet.
- Brug optagelsessoftware fra tredjepart og et kontrolkort (se materialetabellen) til signaloptagelse. Se brugervejledningen til softwaren for detaljerede instruktioner.
- Den designede headstage understøtter 8 kanaler. I softwaren skal du aktivere kanalerne 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 og 23 til optagelse.
2. Elektrode fabrikation
- Skær PFA-belagte wolframtråde (se materialetabel) til specifikke længder for forskellige elektrodetyper: præfrontal cortexelektrode (12 mm), hippocampuselektrode (10 mm) og jordelektrode (6 mm).
- Skær messingrøret (se materialetabellen) i 3 mm segmenter.
- Fjern 2 mm af belægningen i enden af hver ledning ved hjælp af en lighter, og lod derefter elektrodetråden sikkert til messingrøret. Messingrøret har en indvendig diameter på 0,45 mm og en udvendig diameter på 0,60 mm.
- Til jordelektroden loddes en M1.2 rustfri stålskrue (se materialetabellen) på elektroden. Påfør fosforsyrebaseret flux på skruen for at forbedre lodningen. Efter lodning rengøres skruen med alkohol.
BEMÆRK: Brug handsker til beskyttelse under loddeprocessen.
3. Kirurgisk indgreb
- Bedøv musen i et anæstesikammer med 3% isofluran og 1 L/min iltgennemstrømning.
- Placer den bedøvede mus på en varmepude og fastgør den i en stereotaksisk ramme (se materialetabel).
- Juster vedligeholdelseshastigheden for isofluran til 2,5-3% og reducer iltstrømmen til 500 ml/min. Brug tåklemmen til at kontrollere, om dyret stadig er under dyb anæstesi.
- Injicer carprofen subkutant ved 0,5 mg/kg og påfør øjensalve til øjenbeskyttelse.
- Barber og steriliser musens hoved ved hjælp af povidon-jod og 80% ethanol.
- Lav et 8 mm snit langs hovedbundens midterlinje, fjern bindevæv i snitområdet.
- Påfør hydrogenperoxid for at rense overfladen af kraniet, og vær forsigtig med ikke at røre ved den omgivende hud.
- Juster bregma- og lambda-landemærkerne til samme niveau for nøjagtig elektrodeplacering (bregma og lambda er, hvor sagittalsuturen skærer koronale og lambdoide suturer).
- Bor huller til reference-/jordelektrode, ankerskruer (0,9 mm boregrater) og aktive elektroder (0,3 mm boregrater) ved specificerede koordinater.
- Fastgør den specialfremstillede elektrode (trin 2) til den stereotaksiske rammearm, og sørg for, at den er vinkelret på hjernen.
- Implanter elektroden i hippocampus CA1-området (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
BEMÆRK: AP, anteroposterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventrale. - Gentag elektrodeimplantation i den præfrontale cortex (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Fastgør elektroder med et kommercielt tilgængeligt kraftigt klæbemiddel og tandcement (se materialetabel).
- Implanter to 1,2 mm ankerskruer (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) for at forhindre bevægelse.
- Placer reference-/jordelektroden i direkte kontakt med dura mater, 2 mm bageste og 2 mm ensidig i forhold til lambda-vartegnet.
- Tilslut messingrørsiden af elektroderne til et flerkanals stik (se materialetabellen) med jordelektroden i midten.
- Brug 0,8 mm varmekrympeslange på ydersiden af den midterste stift til isolering.
- Fastgør elektroderne, ankerskruerne og konnektoren med klæbemiddel og tandcement.
4. Postoperativ pleje
- For at lindre postoperative smerter injiceres carprofen i en dosis på 5-10 mg/kg subkutant hver 12.-24. time baseret på en vurdering af smerte i en periode på tre dage.
- Giv dyret en uges restitutionsperiode, inden der påbegyndes registrerings- eller forsøgsprocedurer.
5. Procedure for registrering
- Håndter dyret i 15 min, to gange dagligt, i tre på hinanden følgende dage.
- Tag musene op ved forsigtigt at lukke hånden omkring dem uden at lægge for stort pres.
- Placer headstagebrættet på dyrets hoved i 30 minutter en gang om dagen i tre på hinanden følgende dage.
- På optagedagen akklimatiseres dyret til optagerummet i 30 min.
- Placer dyret i et lille optagekammer i et Faraday-bur for at reducere ekstern elektrisk interferens. Vedhæft det brugerdefinerede headstage til optagelse.
- Åbn optagelsessoftwaren, og vælg en samplinghastighed på 2,00 kHz. Deaktiver alle kanaler undtagen 13 og 20 ved at vælge hver kanal og trykke på mellemrumstasten.
- I vinduet med hardwarebåndbredde skal du indstille den lavere båndbredde til 2 Hz og den øvre båndbredde til 100 Hz.
- I softwarefiltreringsvinduet skal du justere lavpasfilteret til 100 Hz og højpasfilteret til 2 Hz.
- Vælg lagringsstien ved at klikke på Vælg filnavn, og klik derefter på Optag.
- Start hver optagelsessession med en 10 minutters tilvænningsperiode efterfulgt af en 15 minutters baseline EEG-optagelse.
- Efter baseline optagelse, administrere lægemidlet via intraperitoneal injektion og fortsætte optagelsen i yderligere 30 min uden forsinkelse.
BEMÆRK: Se afsnittet Resultater for detaljer om de anvendte lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne vist her viser virkningerne af flere lægemidler på lokale feltpotentialer (LFP'er) egenskaber testet i fire kohorter af C57BL/6 hanmus (n = 8 for hver kohorte; alder: 8 uger; vægt: 24,0 ± 0,42 g). De testede lægemidler omfattede det antipsykotiske lægemiddel clozapin, kaliumkanalmodulatorerne 4-aminopyridin (4-AP) og retigabin samt kontrolkøretøjets saltvand.
Som vist i figur 1 blev musen placeret i et lille optagekammer, og LFP'er blev indsamlet fra hippocampus (HIP) og præfrontal cortex (PFC) ved hjælp af et specialdesignet headstage. Da denne undersøgelse primært fokuserede på undersøgelsen af theta- og gammafrekvensbåndene, gennemgik det optagede signal først indledende båndpasfiltrering inden for et frekvensområde på 2-100 Hz efterfulgt af sampling ved 2000 Hz. Signalet blev derefter opdelt i flere 2 s epoker. Alle epoker, der viste udtalte bevægelsesartefakter, blev identificeret og efterfølgende udelukket fra efterfølgende analyseprocesser. Effektspektre af LFP'er i både HIP og PFC samt HIP-PFC-kohærensen blev målt ved hjælp af en multikonusbaseret analysemetode9. Analysen brugte fem Slepian tapers, og tidsbåndbredden blev indstillet til tre for at opnå den optimale spektralkoncentration. Et glidende vindue på 1 s og en trinstørrelse på 100 ms blev brugt til at generere tidsfrekvensspektrogrammer og tidsforløbet for HIP-PFC-kohærensen.
Som vist i figur 2 og figur 3 havde administrationen af saltvand ingen mærkbar effekt på effektspektrene af LFP'er i HIP og PFC eller HIP-PFC-kohærens. Både retigabin og clozapin viste klare reduktioner i gammabåndets (30-100 Hz) effekt i HIP og PFC samt gammabåndets HIP-PFC-kohærens. I modsætning hertil udviste 4-AP de modsatte virkninger, karakteriseret ved forbedret gammabåndeffekt i HIP og PFC sammen med en øget sammenhæng inden for gammabåndet mellem HIP og PFC.
Figur 1: Skematisk oversigt over den eksperimentelle opsætning. Elektroder blev implanteret i hippocampus (HIP) og den præfrontale cortex (PFC) til registrering af lokale feltpotentialer. Dyret blev anbragt i et lille optagekammer, og et specialdesignet hovedscene blev fastgjort til elektrodestikket. Hver optagelsessession begyndte med en 10 minutters baseline-session, som blev efterfulgt af en 30 minutters narkotikasession. Virkningerne af saltvand, clozapin, 4-AP og retigabin blev testet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkningen af antipsykotiske lægemidler og kaliumkanalmodulatorer på den igangværende elektrofysiologiske aktivitet i hippocampus (HIP) og præfrontale cortex (PFC). Det normaliserede spektrogram af de lokale feltpotentialer i HIP og PFC sammen med HIP-PFC-kohærensen udviste tidsafhængige virkninger for alle de undersøgte lægemidler. Lægemidlerne blev administreret via intraperitoneal injektion på tidspunktet t = 15 min. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Virkningen af antipsykotiske lægemidler og kaliumkanalmodulatorer på effektspektretætheden i HIP og PFC. 4-AP forbedrede signifikant gammabåndseffekten i begge hjerneområder, mens clozapin og retigabin undertrykte gammabåndseffekt i begge regioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, skitserer proceduren for konstruktion af et tilpasset headstage, der er specielt designet til samtidig registrering af dobbelte lokale feltpotentialer (LFP'er) i hippocampus (HIP) og præfrontale cortex (PFC). De detaljerede trin i denne protokol giver tilstrækkelig information til, at forskere grundigt kan undersøge signalkommunikation både inden for hver region og mellem HIP og PFC.
Den specialdesignede headstage bruger en kommerciel forstærkerchip. Mens den nuværende konfiguration understøtter optagelse af 8 kanaler, kan headstage let tilpasses til at rumme den fulde 32-kanals kapacitet, hvilket giver potentiale for udvidet kanalkapacitet, der er egnet til elektrodearrayoptagelse. I betragtning af de lave omkostninger ved hovedscenen er en mulighed at fastgøre brættet permanent på dyrets hoved. Denne tilgang giver fordelen ved at minimere bevægelsesartefakter og reducere det samlede niveau af forstyrrelse forårsaget af bevægelse.
Den specialfremstillede elektrode demonstrerer stabil langsigtet optagelse af LFP'er og opretholder god signalkvalitet over en periode på 3-5 måneder. En anden levedygtig tilgang indebærer anvendelse af polyimidbaserede fleksible kredsløb som elektrodearrays10,11. Disse fleksible printkort kan integreres med optagelseshovedet for at muliggøre optagelse med flere kanaler. Denne metode giver fordelen ved at forenkle elektrodeforberedelse og kirurgiske procedurer. Implantatets vægt med og uden hovedkulde er meget let med henholdsvis 0,198 g og 0,812 g, hvilket gør det velegnet til meget unge mus.
En begrænsning af den nuværende registreringsteknik er den potentielle interferens forårsaget af hængekablet, som kan forstyrre dyrets naturlige opførsel under forsøg. For at løse dette problem kan alternative løsninger såsom at bruge et SD-kort til datalagring eller implementering af et trådløst signalsendermodul overvejes.
Et væsentligt og kritisk trin i protokollen involverer den nøjagtige placering af elektroden. Det er afgørende at sikre præcis og ensartet elektrodeplacering for at muliggøre sammenlignelighed på tværs af eksperimenter. For at verificere elektrodens placering skal histologi udføres12. En nyttig teknik til at forbedre korrekt elektrodepositionering i HPC er at optage, mens elektroden indsættes lodret, da stærke thetarytmer og neuronal affyring vil indikere korrekt placering. Det anbefales at bruge voksne mus, der er ældre end 8 uger, da signalkvaliteten kan falde over tid eller resultere i forkert placering, når musene bliver ældre. Hensyntagen til disse overvejelser vil bidrage til at opretholde pålideligheden og gyldigheden af forsøgsresultaterne.
Afslutningsvis giver protokollen, der præsenteres i denne artikel, en ramme for at studere signalkommunikationen mellem forskellige hjerneområder. Det gør det muligt for forskere at udforske neuronal dynamik og interaktioner inden for og mellem disse regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
