Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von Gift aus Trichogramma dendrolimi unter Verwendung eines künstlichen Wirts vor, der mit Polyethylenfilm und Aminosäurelösung hergestellt wurde.
Abstract
Parasitoide Wespen sind eine vielfältige Gruppe von Hautflüglerinsekten, die als unschätzbare Ressourcen für die biologische Schädlingsbekämpfung dienen. Um einen erfolgreichen Parasitismus zu gewährleisten, injizieren parasitoide Wespen Gift in ihre Wirte, um die Immunität ihrer Wirte zu unterdrücken und die Entwicklung, den Stoffwechsel und sogar das Verhalten der Wirte zu modulieren. Mit über 600.000 geschätzten Arten übertrifft die Vielfalt der parasitoiden Wespen die anderer giftiger Tiere wie Schlangen, Kegelschnecken und Spinnen. Parasitoides Wespengift ist eine wenig erforschte Quelle bioaktiver Moleküle mit potenziellen Anwendungen in der Schädlingsbekämpfung und Medizin. Das Sammeln von parasitoidem Gift ist jedoch eine Herausforderung, da es nicht möglich ist, direkte oder elektrische Stimulation zu verwenden, und die Dissektion aufgrund ihrer geringen Größe schwierig ist. Trichogramma ist eine Gattung winziger (~0,5 mm) Ei-Parasitoid-Wespen, die zur biologischen Bekämpfung von Lepidoptera-Schädlingen sowohl in der Landwirtschaft als auch in der Forstwirtschaft weit verbreitet sind. Hier berichten wir über eine Methode zur Extraktion von Gift aus T. dendrolimi unter Verwendung künstlicher Wirte. Diese künstlichen Wirte werden mit Polyethylenfolie und Aminosäurelösungen erzeugt und dann mit Trichogramma-Wespen gegen Parasitismus geimpft. Das Gift wurde anschließend aufgefangen und konzentriert. Diese Methode ermöglicht die Extraktion großer Mengen von Trichogramma-Gift und vermeidet gleichzeitig eine Kontamination durch andere Gewebe, die durch die Dissektion verursacht wird, ein häufiges Problem bei Giftreservoir-Dissektionsprotokollen. Dieser innovative Ansatz erleichtert die Untersuchung des Giftes von Trichogramma und ebnet den Weg für neue Forschungen und potenzielle Anwendungen.
Introduction
Schlupfwespen sind parasitäre Hautflüglerinsekten, die wichtige Ressourcen für die biologische Bekämpfung darstellen1. Es gibt eine große Vielfalt an parasitoiden Wespen mit schätzungsweise über 600.000 Arten2. Die Vielfalt der Schlupfwespen übersteigt die anderer giftiger Gliederfüßer wie Schlangen, Kegelschnecken, Spinnen, Skorpione und Bienen bei weitem. Gift ist ein wichtiger parasitärer Faktor bei Schlupfwespen. Für einen erfolgreichen Parasitismus wird Gift in den Wirt injiziert, wodurch das Verhalten, die Immunität, die Entwicklung und der Stoffwechsel des Wirts moduliertwerden 3. Darüber hinaus weist das Gift parasitoider Wespen eine bemerkenswerte Vielfalt in seinen molekularen Strukturen, Zielen und Funktionen auf, was eine komplexe Koevolution mit ihren Wirten widerspiegelt. Daher ist parasitoides Gift eine wertvolle und unterschätzte Ressource aktiver Moleküle für insektizide oder medizinische Zwecke4. Im Gegensatz zum Gift von Schlangen, Kegelschnecken, Spinnen, Skorpionen und Bienen kann parasitoides Wespengift nicht durch direkte Stimulation oder elektrische Stimulation gesammelt werden5. Die derzeitige Methode zur Extraktion von parasitoidem Wespengift besteht darin, das Giftreservoir zu sezieren. Parasitoide Wespen sind jedoch oft klein, und das Sezieren von parasitoiden Wespen erfordert hohe technische Fähigkeiten. Wenn wir also einen Weg finden, das Gift von Schlupfwespen effizient und bequem zu sammeln, wird es eine große Hilfe sein, das Gift von Schlupfwespen zu erforschen.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) ist eine Gattung winziger (~0,5 mm langer) parasitoider Wespen6. Diese Wespen gehören zu den am weitesten verbreiteten biologischen Schädlingsbekämpfungsmitteln, insbesondere gegen Eier verschiedener Schmetterlingsschädlinge in der Land- und Forstwirtschaft. Zum Beispiel wurde T. dendrolimi, eine der am weitesten verbreiteten Trichogramma-Arten in China, in großem Umfang zur Bekämpfung einer Vielzahl von land- und forstwirtschaftlichen Schädlingen wie Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis und Chilo suppressalis eingesetzt. Frühere Studien zeigten, dass Trichogramma-Wespen ihre Eier in künstliche Wirte injizieren konnten7. Künstliche Wirte können mit Materialien wie Wachs8, Agar9, Parafilm10 und Kunststofffolie11 hergestellt werden. Die Lösung in künstlichen Wirten, die eine ausreichende Eiablage für Trichogramma induziert, kann einfach sein, wie z. B. Aminosäuren oder anorganische Salze12. Basierend auf der Eigenschaft, dass T. dendrolimi künstliche Wirte parasitieren kann, bietet diese Studie eine neue Methode zur Extraktion von Gift aus parasitoiden Wespen mit Hilfe künstlicher Wirte. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Unzulänglichkeiten der geringen Ausbeute, der geringen Reinheit und der Anfälligkeit für Verunreinigungen in den derzeitigen Extraktionstechniken zu beheben. Mit dieser Methode kann eine große Menge an hochreinem Gift aus T. dendrolimi extrahiert werden, das den Anforderungen der wissenschaftlichen Forschung und des Screenings bioaktiver Moleküle für insektizide oder medizinische Zwecke entspricht.
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Protocol
1. Insektenzucht
- Corcyra cephalonica auf Maismehl bei einer Temperatur von 26 ± 1°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40% ± 10% füttern.
- Züchten Sie den Stamm T. dendrolimi aus dem Jilin-Insektarium in Innenräumen, indem Sie die Eier von Corcyra cephalonica als Wirte verwenden. Füttern Sie erwachsene Wespen mit 10 % Saccharosewasser in Drosophila-Röhrchen bei einer Temperatur von 26 ± 1 °C, relativer Luftfeuchtigkeit von 70 % ± 10 %, hell (L): dunkel (D) Periode von 14 h: 10 h.
2. Vorbereitung von Eierkarten aus Polyethylen-Kunststofffolie
- Nehmen Sie eine Polyethylen-Kunststofffolie mit einer Länge von 16 cm, einer Breite von 12 cm und einer Dicke von 20 μm. 30 halbkreisförmige Vorsprünge mit einem Durchmesser von 2-3 mm und einer Höhe von ca. 3 mm werden mit einem Glasschleifstab nach dem Standard-PCR-Plattenlayout von 96 Löchern herausgedrückt.
HINWEIS: Beim Auspressen von 30 halbkreisförmigen Vorsprüngen mit einem Glasschleifstab muss auf den Druck geachtet werden, da ein zu starker Druck den Kunststoff durchbohrt und den extrahierten giftlosen Mahlstab verunreinigt. - Desinfizieren Sie die gepresste Polyethylen-Kunststofffolie, indem Sie beide Seiten 1 h lang ultraviolettem (UV) Licht aussetzen.
- Geben Sie eine kleine Menge 10%igen Polyvinylalkohol auf die halbkreisförmige Oberfläche.
3. Trichogramma dendrolimi Parasitismus
- Nach der CO2 - Narkose wurden die weiblichen Wespen von T. dendrolimi in eine Sammelbox gegeben, und die Anzahl der Wespen betrug ~3000.
- Legen Sie die gewölbte Seite der Folieneierkarte in Richtung der Auffangbox und fixieren Sie die Ränder mit einem Gummiband.
- 4 μl Aminosäurelösung (6 g/l Leucin, 4 g/l Phenylalanin, 4,25 g/l Histidin) zu jedem halbkreisförmigen Vorsprung hinzufügen. Decken Sie es mit einer flachen Polyethylen-Kunststofffolie von 16 cm Länge und 12 cm Breite ab. Verwenden Sie ein Gummiband, um die Auffangbox fest mit zwei Plastikfolien abzudecken.
- Lassen Sie T. dendrolimi-Wespen 4-8 h lang frei parasitieren und liefern Sie 10% Saccharosewasser durch befeuchtete Baumwolle.
4. Sammeln von T. dendrolimi Gift
- Entnehmen Sie die parasitierte Aminosäurelösung aus dem inneren Vorsprung der künstlichen Eikarte und geben Sie sie auf den Deckel von 1,5-ml-Röhrchen.
- Decken Sie die Röhrchenkappe mit einem 10 μm Nylonnetz mit 25 mm Durchmesser ab, befestigen Sie das Nylonnetz und das Zentrifugenröhrchen fest. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen für eine kurze Zentrifugation mit einer Mini-Zentrifuge (1360 x g) für 10 s aufrecht und sammeln Sie die filtrierte Lösung (~100 μl T. dendrolimi-Gift ).
- Messen Sie die Konzentration des gesammelten T. dendrolimi-Giftes mit einem Bicinchoninsäure-Assay-Kit (BCA) (Materialtabelle).
- Lagern Sie das Gift für weitere Analysen bei -80 °C.
5. SDS-PAGE-Analysen
- 30 μl T. dendrolimi-Gift zu 10 μl 4x Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Probenladepuffer (SDS-PAGE) (Materialtabelle) geben und 10 min bei 95 °C erhitzen.
- SDS-PAGE-Gellauf bei 130 V für 120 Minuten durchführen.
- Färben und entfärben Sie das SDS-PAGE-Gel mit dem Proteinfärbegerät (Materialtabelle).
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Representative Results
Die Proteinkonzentration repräsentativer Giftproben wurde mit dem Protein-Assay-Kit gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 dargestellt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die Konzentration des mit dieser Methode gesammelten Giftproteins zwischen 0,35 μg/μl und 0,46 μg/μl lag, während die Negativkontrolle der Aminosäurelösung nur eine Proteinkonzentration von 0,03 μg/μl bis 0,05 μg/μl aufwies. Die Konzentration des Giftproteins, das mit dieser Methode gesammelt wird, ist viel höher als die der Negativkontrolle, was zeigt, dass diese Methode das Gift von Schlupfwespen gut sammeln kann. Darüber hinaus gibt es keine spezifische Korrelation zwischen der Zeit des Parasitismus und der Konzentration, da verschiedene Chargen von Schlupfwespen eine unterschiedliche Vitalität aufweisen können.
Darüber hinaus wurde das Gift von T. dendrolimi mittels SDS-PAGE analysiert, wobei in Abbildung 1 ein Giftproteinbereich von unter 10 kDa bis über 130 kDa nachgewiesen wurde. Bei der Analyse der Negativkontrolle der Aminosäure mit SDS-PAGE wurde jedoch festgestellt, dass sie kein Protein enthielt (ergänzende Abbildung 1), was auch bewies, dass es sich bei dem mit dieser Methode gesammelten Protein tatsächlich um das Giftprotein von Schlupfwespen handelte.
Abbildung 1: SDS-PAGE-Analyse des Giftproteins von T. dendrolimi. Spuren 1-2: Die beladenen Mengen an Giftprotein betrugen 8 μg bzw. 10 μg. M: Markierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Probe | Parasitismus-Zeit (h) | Konzentration (μg/μL) | |
| Gift | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Steuerung | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabelle 1: Die Konzentrationsinformationen des Giftes und der Kontrolle. Die Proteinkonzentration repräsentativer Gift- und Kontrollproben wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemessen. Kontrolle: die nicht parasitierten Kontrollen. NP: kein Parasitismus
Ergänzende Abbildung 1: SDS-PAGE-Analyse von Kontrolle und Gift. Kontrolle: die nicht parasitierte Kontrolle. Gift: Die beladenen Mengen an Giftprotein betrugen 10 μg. M: Marker. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Extraktion von Gift aus T. dendrolimi unter Verwendung künstlicher Wirte vor. Die wichtigsten Punkte im Experiment mit der Giftsammlung sind folgende. (1) Während der Herstellung muss T. dendrolimi schnell mit einer geeigneten Konzentration vonCO2 betäubt werden. Ist die CO2 - Konzentration zu niedrig, reicht sie nicht aus, um das Trichogramma schnell zu betäuben. Umgekehrt, wenn die Konzentration zu hoch ist, kann Trichogramma absterben, was ihre Fähigkeit, den künstlichen Wirt zu parasitieren, verringert. (2) Die Sterilität der Aminosäurelösung muss sichergestellt sein, da eine Kontamination der Aminosäurelösung die Wirksamkeit des Parasitismus negativ beeinflussen kann. (3) Die Parasitierung von künstlichen Eikarten sollte unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden, um Parasitismus zu fördern. (4) Es wird empfohlen, entweder direkt nachgeschaltete Versuche durchzuführen oder die Proben einzufrieren, um die Giftaktivität sicherzustellen und einen Abbau zu verhindern.
Es wird empfohlen, die Parasitierung anhand der Visualisierung der abgelegten Eizellen zu beurteilen. Wenn die abgelegten Eizellen nicht unter dem Mikroskop beobachtet werden, kann es sein, dass kein Gift entnommen wurde. Die Einschränkung der Technik besteht darin, dass sie eine große Anzahl von parasitoiden Wespen erfordert. Für eine einzelne Giftextraktion werden etwa 3.000 Schlupfwespen benötigt, was den Arbeitsaufwand erhöht.
Die bisherige Methode zur Gewinnung von parasitoidem Wespengift bestand darin, das Giftreservoir zu sezieren. Schlupfwespen sind jedoch winzig; Trichogramma ist zum Beispiel weniger als 1 mm lang. Nicht nur die technischen Anforderungen an die Präparation von Giftreservoirs sind hoch, sondern auch die Kontamination anderer Gewebe während der Präparation ist häufig. Die neuartige Methode mit künstlichen Wirten kann die Effizienz der Giftextraktion verbessern und eine Kontamination durch andere Gewebe durch die Dissektion vermeiden.
Diese Methode kann auch auf andere Schlupfwespen ausgeweitet werden. Zum Beispiel können Polyethylen-Kunststofffolien-Oozyten, die eine Mischung aus Salzionen und Aminosäuren enthalten, verwendet werden, um T. neustadt-Gift zu erhalten, und künstliche Wachseier, die KCl-MgSO4-Lösung enthalten, können verwendet werden, um T. pretiosum-Gift zu erhalten. Zusätzlich zu Trichogramma wurde berichtet, dass Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 und Habrobracon hebetor10 künstliche Wirte parasitieren können. Unter Ausnutzung der Eigenschaften dieser parasitoiden Wespen zur Parasitierung künstlicher Wirte können ähnliche Methoden zur Giftgewinnung entwickelt werden.
Parasitoides Wespengift ist eine wenig erforschte Quelle biologischer Moleküle mit potenziellen Schädlingsbekämpfungs- und medizinischen Anwendungen. In jüngster Zeit wurden die potenziellen Anwendungen von parasitoiden Giften in der Pharmakologie und Landwirtschaft erkannt14,15. Pharmakologisch haben viele Bestandteile des parasitoiden Giftes ein breites Anwendungspotenzial bei der Optimierung der Immuntherapie, der Behandlung thrombotischer Erkrankungen und der Suche nach Vorlagen für neue Antibiotika. In der Landwirtschaft können einige Bestandteile des parasitoiden Giftes als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel verwendet werden, um die Entwicklung, Fortpflanzung und Immunität von Schädlingen zu regulieren und so den Zweck einer wirksamen Schädlingsbekämpfung zu erreichen15. Der Mangel an effizienten Methoden zur Giftgewinnung schränkt jedoch oft die Erforschung des Giftes von Schlupfwespen ein, insbesondere von winzigen Schlupfwespen wie Trichogramma. Diese Arbeit stellt eine effiziente Methode zur Extraktion des Giftes von Trichogramma vor, die eine Methode für die Nachuntersuchung von Trichogramma-Gift bereitstellt, wie z. B. die Identifizierung der Proteinzusammensetzung und der Giftfunktion. Darüber hinaus kann diese Methode auch als Referenz für andere parasitoide Wespengiftforschung verwendet werden und unterstützt die Förderung des Screenings bioaktiver Moleküle aus parasitoiden Giften für insektizide oder medizinische Anwendungen.
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Disclosures
Der Autor hat nichts offenzulegen und keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch die Natural Science Foundation of Hainan Province (Grant No. 323QN262), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31701843 und 32172483), den Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (Grant No. CX(22)3012 und CX(21)3008), die "Shuangchuang Doctor"-Stiftung der Provinz Jiangsu (Stipendium Nr. 202030472) und der Start-up-Fonds der Nanjing Agricultural University (Zuschuss Nr. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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