Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

गतिशील माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में स्टेटिक बैरियर ऊतक मॉडल को बदलना

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/66090
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

Summary

यह प्रोटोकॉल एक पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य झिल्ली-आधारित सेल संस्कृति मंच का वर्णन करता है जो द्रव प्रवाह क्षमताओं के साथ ओपन-वेल प्रारूप को एकीकृत करता है। यह मंच मानक प्रोटोकॉल के साथ संगत है और इंजीनियरिंग और बायोसाइंस प्रयोगशालाओं दोनों की जरूरतों को समायोजित करते हुए, ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर मोड के बीच प्रतिवर्ती संक्रमण की अनुमति देता है।

Abstract

माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम एक प्रयोगशाला सेटिंग में मानव ऊतकों की संरचना और कार्य की नकल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लघु सेल कल्चर प्लेटफॉर्म हैं। हालांकि, इन प्लेटफार्मों ने जैव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से अपनाया नहीं है, जहां द्रव प्रवाह क्षमताओं की कमी के बावजूद, ऊतक बाधाओं की नकल करने के लिए खुले-कुएं, झिल्ली-आधारित दृष्टिकोण स्वर्ण मानक के रूप में कार्य करते हैं। इस मुद्दे को मुख्य रूप से ओपन-वेल सिस्टम के लिए विकसित मानक प्रोटोकॉल और उपकरणों के साथ मौजूदा माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम की असंगति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

यहां, हम एक ओपन-वेल संरचना, प्रवाह वृद्धि क्षमता और पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ संगतता के साथ एक पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य झिल्ली-आधारित मंच बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली एक चुंबकीय असेंबली दृष्टिकोण का उपयोग करती है जो ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक मोड के बीच प्रतिवर्ती स्विचिंग को सक्षम बनाती है। इस दृष्टिकोण के साथ, उपयोगकर्ताओं को मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर खुली अच्छी तरह से प्रारूप में एक प्रयोग शुरू करने और जोड़ने या आवश्यकतानुसार प्रवाह क्षमताओं को हटाने के लिए लचीलापन है. इस प्रणाली के व्यावहारिक उपयोग और मानक तकनीकों के साथ इसकी संगतता को प्रदर्शित करने के लिए, एक एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर को एक ओपन-वेल प्रारूप में स्थापित किया गया था। द्रव प्रवाह को पेश करने के लिए सिस्टम को पुन: कॉन्फ़िगर किया गया था और फिर इम्यूनोस्टेनिंग और आरएनए निष्कर्षण का संचालन करने के लिए ओपन-वेल प्रारूप में स्विच किया गया था। पारंपरिक ओपन-वेल प्रोटोकॉल और प्रवाह वृद्धि क्षमता के साथ इसकी संगतता के कारण, इस पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य डिजाइन को इंजीनियरिंग और बायोसाइंस प्रयोगशालाओं दोनों द्वारा अपनाया जाने की उम्मीद है।

Introduction

संवहनी बाधाएं एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस के रूप में काम करती हैं जो रक्त डिब्बे को आसपास के ऊतक से अलग करती हैं। वे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आकर्षित करके, आणविक पारगम्यता को नियंत्रित करके, और ऊतक 1,2 में रोगजनकों की घुसपैठ के खिलाफ परिरक्षण करके होमियोस्टैसिस को संरक्षित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन विट्रो संस्कृति मॉडल में विवो microenvironment में नकल करने के लिए विकसित किया गया है, कारकों और शर्तों है कि स्वस्थ और रोगग्रस्तदोनों राज्यों 3,4 में बाधा गुणों को प्रभावित में व्यवस्थित जांच को सक्षम करने.

इस तरह के संस्कृति मॉडल के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण ट्रांसवेल की तरह "खुली अच्छी तरह से" विन्यास5, जहां एक झरझरा, ट्रैक etched संस्कृति झिल्ली मीडिया से भरे डिब्बों (चित्रा 1 ए) अलग है. इस प्रारूप में, कोशिकाओं झिल्ली के दोनों ओर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित की गई है. हालांकि, इन प्रणालियों बाधा परिपक्वता का समर्थन और विवो 5,6 में देखा प्रतिरक्षा सेल परिसंचरण की नकल के लिए आवश्यक द्रव प्रवाह प्रदान करने की उनकी क्षमता में सीमित हैं. नतीजतन, वे गतिशील प्रवाह है कि दवा खुराक, यांत्रिक उत्तेजना, या तरल पदार्थ प्रेरित कतरनी तनाव 6,7,8 परिचय की आवश्यकता के अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता.

ओपन-वेल सिस्टम की सीमाओं को दूर करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म जो व्यक्तिगत रूप से पता करने योग्य तरल पदार्थ चैनलों के साथ झरझरा संस्कृति झिल्ली को जोड़ते हैं,9 विकसित किए गए हैं। ये प्लेटफॉर्म द्रव मार्ग, छिड़काव, और रासायनिक यौगिकों, नियंत्रित कतरनी उत्तेजना, और गतिशील सेल जोड़ क्षमताओं 7,10,11,12,13की शुरूआत पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों द्वारा प्रदान की उन्नत क्षमताओं के बावजूद, वे जटिल microfluidic प्रोटोकॉल और स्थापित प्रयोगात्मकवर्कफ़्लोज़ 4,10,14के साथ उनकी असंगति के कारण जैव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने नहीं देखा है.

इन प्रौद्योगिकियों के बीच की खाई को पाटने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो चुंबकीय रूप से पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य, मॉड्यूल-आधारित प्रणाली को नियोजित करता है। इस प्रणाली को प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक मोड के बीच आसानी से स्विच किया जा सकता है। प्लेटफ़ॉर्म में एक ओपन-वेल डिवाइस है, जिसे m-μSiM (सिलिकॉन झिल्ली द्वारा सक्षम मॉड्यूलर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम) के रूप में जाना जाता है, जिसमें 100 एनएम मोटी संस्कृति झिल्ली (नैनोमेम्ब्रेन) है। इस नैनोमेम्ब्रेन में उच्च सरंध्रता (15%) और कांच जैसी पारदर्शिता है, जैसा कि चित्र 1बी में दिखाया गया है। यह शारीरिक रूप से एक नीचे चैनल से शीर्ष डिब्बे को अलग करता है, शारीरिक लंबाई तराजू15 भर में आणविक परिवहन के लिए अनुमति देता है. पारंपरिक ट्रैक-नक़्क़ाशीदार झिल्ली के विपरीत, जिनके पास उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के साथ इमेजिंग लाइव कोशिकाओं में ज्ञात चुनौतियां हैं, नैनोमेम्ब्रेन के अनुकूल ऑप्टिकल और भौतिक गुण झिल्ली सतह15,16,17के दोनों ओर कोशिकाओं के स्पष्ट दृश्य को सक्षम करते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष बीजारोपण और प्रवाह मॉड्यूल के निर्माण की रूपरेखा तैयार करता है और मंच के चुंबकीय पुनर्विन्यास की व्याख्या करता है। यह दर्शाता है कि स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों के तहत एंडोथेलियल बाधाओं को स्थापित करने के लिए मंच को कैसे नियोजित किया जा सकता है। इस प्रदर्शन से पता चलता है कि एंडोथेलियल कोशिकाएं प्रवाह दिशा के साथ संरेखित होती हैं, कतरनी उत्तेजना के तहत कतरनी-संवेदनशील जीन लक्ष्यों के अपग्रेडेशन के साथ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस डिजाइन प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और अंत उपयोगकर्ता की वरीयताओं के आधार पर विभिन्न मोड में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक प्रयोग से पहले, प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कदम और मॉड्यूल निर्धारित करने के लिए चित्रा 2 में प्रस्तुत निर्णय प्रवाह चार्ट से परामर्श करें। उदाहरण के लिए, यदि उपयोगकर्ता सीधे ट्रांसवेल-प्रकार प्रणाली के साथ तुलना करने के लिए एक प्रयोग के दौरान ओपन-वेल प्रारूप को बनाए रखने का इरादा रखता है, तो सेल सीडिंग के लिए पैटर्निंग स्टैंसिल की आवश्यकता नहीं होती है। कोर मॉड्यूल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें), और अल्ट्राथिन नैनोमेम्ब्रेन को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप विभिन्न छिद्र और ताकना आकार वाली सामग्रियों के पुस्तकालय से चुना जा सकता है।

1. पैटर्निंग स्टैंसिल का निर्माण

नोट: पैटर्निंग स्टैंसिल झिल्ली चिप के झरझरा क्षेत्र पर विशेष रूप से कोशिकाओं की स्थिति के लिए कार्य करता है, जहां वे संभावित रूप से प्रवाह मॉड्यूल16 जोड़ा जाता है के बाद क्षति का अनुभव कर सकता है, आसपास के सिलिकॉन परत पर बसने से कोशिकाओं को रोकने ( चित्रा 3 देखें). मोनोलेयर को नुकसान बाधा अखंडता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है और प्रयोगात्मक परिणामों से समझौता कर सकता है। एक खुली, स्थिर संस्कृति में स्टैंसिल अनावश्यक है, क्योंकि क्षति का कोई खतरा नहीं है।

  1. पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 (चित्रा 4ए)में प्रदान किए गए डिज़ाइन का उपयोग करके खरीद, मशीन या 3 डी प्रिंट करें।
    नोट: स्टैंसिल दीवारों को मीडिया क्षमता बढ़ाने और उच्च पहलू अनुपात सीधी-दीवार वाली सुविधाओं की तुलना में बुलबुला फँसाने को कम करने के लिए पतला किया जाता है।
  2. एक ठंड रोलर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर एक 3.2 मिमी एक्रिलिक शीट के लिए एक 130 माइक्रोन दबाव के प्रति संवेदनशील चिपकने वाला (पीएसए) फिल्म संलग्न करें.
  3. लेजर ने गुहाओं की एक सरणी बनाने के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 में प्रदान किए गए डिजाइन के अनुसार ऐक्रेलिक शीट को काट दिया(चित्र 4बी)।
  4. पीएसए फिल्म से सुरक्षात्मक परत को छीलें और ऐक्रेलिक शीट को मोल्ड से संलग्न करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि लेजर-कट शीट मोल्ड के साथ संरेखित है ताकि मोल्ड विशेषताएं गुहा (चित्रा 4सी)के भीतर केंद्रित हों। झिल्ली पर सेल की स्थिति की सटीकता इस कदम पर निर्भर करती है।
  5. पूरी तरह से पीडीएमएस प्रीपोलीमर (उत्प्रेरक अनुपात के लिए 10: 1 आधार का उपयोग करके) ( सामग्री की तालिकादेखें) मिलाएं और इसे वैक्यूम कक्ष में तब तक मिलाएं जब तक कि कोई दृश्यमान बुलबुले न रह जाएं (5-15 मिनट)।
  6. धीरे-धीरे पीडीएमएस को मोल्ड गुहाओं में डालें, इसे एक सपाट किनारे के साथ समतल करें।
    नोट: बुलबुला फंसाने को रोकने के लिए, पीडीएमएस को प्रत्येक गुहा में धीरे-धीरे डालें। यदि बुलबुले डालने के बाद मौजूद हैं, तो मोल्ड को वैक्यूम कक्ष में रखें और इसे फिर से डीगैस करें।
  7. 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक हॉटप्लेट पर पीडीएमएस का इलाज करें, और फिर इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।
  8. फ्लैट-इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग करके मोल्ड गुहाओं से स्टेंसिल निकालें।

2. प्रवाह मॉड्यूल का निर्माण

नोट: प्रवाह मॉड्यूल कोर मॉड्यूल के तिपतिया घास के आकार के कुएं के साथ एक समान पदचिह्न साझा करता है और इसमें एक ढाला माइक्रोचैनल (चौड़ाई = 1.5 मिमी, ऊंचाई = 0.2 मिमी, लंबाई = 5 मिमी) शामिल है। तिपतिया घास का आकार झरझरा संस्कृति क्षेत्र (चित्रा 5) पर चैनल को संरेखित करने में सहायता करता है।

  1. पूरक कोडिंग फ़ाइल 3(चित्रा 4डी)में प्रदान की डिजाइन द्वारा परिभाषित सुविधाओं के साथ एक सिलिकॉन मोल्ड बनाने के लिए मानक नरम लिथोग्राफी तकनीक18 का उपयोग करें।
  2. एक 3.2 मिमी मोटी एक्रिलिक शीट के लिए एक 130 माइक्रोन पीएसए फिल्म संलग्न करें।
  3. लेजर ने तिपतिया घास के आकार के गुहाओं की एक सरणी बनाने के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइल 4 में दिए गए डिज़ाइन के आधार पर ऐक्रेलिक शीट को काट दिया(चित्र 4ई)।
    नोट: गुहा की ऊंचाई प्रवाह मॉड्यूल की ऊंचाई निर्धारित करती है, जो उचित सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए कोर मॉड्यूल की ऊंचाई से थोड़ा लंबा (0-0.1 मिमी तक) होना चाहिए।
  4. पीएसए फिल्म से सुरक्षात्मक परत निकालें और फिर लेजर-कट शीट पर उन लोगों के साथ सिलिकॉन मोल्ड पर त्रिकोणीय संरेखण के निशान को संरेखित करके लेजर-कट शीट को सिलिकॉन मोल्ड में संलग्न करें।
    नोट: चरण 1.4 के समान, सुनिश्चित करें कि लेजर-कट ऐक्रेलिक शीट सिलिकॉन मोल्ड के साथ गठबंधन की गई है ताकि मोल्ड विशेषताएं प्रत्येक गुहा(चित्रा 4एफ)के भीतर केंद्रित हों। यह चरण पदचिह्न के सापेक्ष माइक्रोचैनल की स्थिति निर्धारित करता है।
  5. धीरे-धीरे degassed PDMS को मोल्ड गुहाओं पर डालें और इसे एक सपाट किनारे के साथ समतल करें।
    नोट: यदि बुलबुले डालने के बाद मौजूद हैं, तो बुलबुले हटाए जाने तक मोल्ड को डीगैस करें।
  6. मोल्ड को हॉटप्लेट पर रखें और पीडीएमएस को 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, फिर मोल्ड को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
  7. ध्यान से फ्लैट इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग मोल्ड गुहाओं से प्रवाह मॉड्यूल को हटा दें.
  8. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ microchannel सुविधाओं के साथ प्रवाह मॉड्यूल ओरिएंट, और एक बायोप्सी पंच ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर चैनल के अंत में कोर इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों स्थिति.

3. निचले और ऊपरी ऐक्रेलिक आवासों का निर्माण

नोट: कोर मॉड्यूल निचले आवास में फिट बैठता है। आवासों में एम्बेडेड मैग्नेट के बीच आकर्षण प्रवाह मॉड्यूल को कोर मॉड्यूल(चित्रा 6)को संपीड़ित और सील करता है।

  1. चुंबक सम्मिलन के लिए छेद के साथ ऊपरी आवास बनाने के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइल 5 में प्रदान किए गए डिज़ाइन का उपयोग करके लेजर-कट 2 मिमी ऐक्रेलिक शीट।
  2. एक 3.5 मिमी एक्रिलिक शीट के लिए एक 130 माइक्रोन पीएसए फिल्म संलग्न करें।
  3. चुंबक सम्मिलन के लिए छेद के साथ निचले आवास बनाने के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइल 6 में दिए गए डिज़ाइन के आधार पर ऐक्रेलिक शीट को लेजर-कट करें।
    नोट: निचले आवास की मोटाई एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है और प्रवाह के दौरान रिसाव को रोकने के लिए कोर मॉड्यूल की समग्र मोटाई से मेल खाना चाहिए।
  4. पीएसए सुरक्षात्मक परत निकालें और निचले आवास को एक ग्लास कवरस्लिप से संलग्न करें।
  5. प्रेस-फिट 4.75 मिमी निकल-प्लेटेड नियोडिमियम मैग्नेट ( सामग्री की तालिकादेखें) आवासों के लेजर-कट छेद में।
    नोट: सुनिश्चित करें कि निचले और ऊपरी आवासों में मैग्नेट चुंबकीय आकर्षण(चित्रा 6)सुनिश्चित करने के लिए विपरीत ध्रुवीयता के साथ रखा जाता है।

4. प्रवाह सर्किट का निर्माण

नोट: बंद लूप प्रवाह सर्किट जलाशयों (चित्रा 7) के रूप में दो नमूना संग्रह शीशियों शामिल हैं. इनलेट जलाशय में एक पॉलीविनाइलिडीन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) फिल्टर होता है जो सेल मीडिया को इनक्यूबेटर में सीओ2 एकाग्रता के साथ संतुलित करने की अनुमति देता है।

  1. एक नमूना संग्रह शीशी की टोपी में दो छेद बनाने के लिए एक 1 मिमी बायोप्सी पंच का प्रयोग करें.
  2. एक अलग नमूना संग्रह शीशी की टोपी में दो छेद (1 मिमी और 4 मिमी) बनाने के लिए बायोप्सी घूंसे का प्रयोग करें, और इस शीशी के निचले हिस्से में 1 मिमी छेद बनाएं।
  3. 1 मिमी छेद में से प्रत्येक में 20 जी वितरण युक्तियाँ डालें और उन्हें गर्म गोंद के साथ सील करें।
  4. 4 मिमी छेद में 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) रखें और इसे गर्म गोंद के साथ सील करें।
  5. लेजर-कट एक 1.5 मिमी एक्रिलिक शीट पूरक कोडिंग फ़ाइल 7 में प्रदान की डिजाइन का उपयोग कर एक नमूना होल्डिंग चरण बनाने के लिए.
  6. ऐक्रेलिक चरण पर जलाशयों की स्थिति।
  7. सूक्ष्म प्रवाह ट्यूबों का उपयोग कर वितरण सुझावों कनेक्ट ( सामग्री की तालिकादेखें).
  8. ट्यूबों को 21 जी वितरण युक्तियों का उपयोग करके प्रवाह मॉड्यूल के इनलेट और आउटलेट से लिंक करें।
  9. प्रवाह परिसंचरण के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    नोट: सिरिंज या वायवीय पंप भी वांछित अगर प्रवाह शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवाह दर प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. एक प्रयोगात्मक रूप से मान्य COMSOL मॉडल से प्राप्त एक व्यापक तालिका, सेल मोनोलेयर16 पर वांछित कतरनी तनाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रवाह दर का चयन करने में उपयोगकर्ताओं की सहायता के लिए पूरक तालिका 1 में प्रदान की जाती है।

5. सेल सीडिंग

नोट: पारंपरिक झिल्ली आवेषण के समान, विभिन्न सेल प्रकारों को नैनोमेम्ब्रेन पर सुसंस्कृत किया जा सकता है। एक माध्यमिक सेल प्रकार भी नीचे चैनल15 में झिल्ली के दूसरी तरफ सह सुसंस्कृत किया जा सकता है.

  1. सेल लगाव में सुधार करने के लिए 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर फाइब्रोनेक्टिन के 5 माइक्रोग्राम/सेमी2 ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ झिल्ली को कोट करें।
    नोट: चुना गया सेल प्रकार आवश्यक कोटिंग और सेल घनत्व को प्रभावित कर सकता है। यहाँ वर्णित प्रक्रिया मानव गर्भनाल नसों endothelial कोशिकाओं के लिए है (HUVECs, सामग्री की तालिकादेखें).
  2. एक P200 विंदुक का उपयोग कोटिंग समाधान महाप्राण और कोर मॉड्यूल में अच्छी तरह से एक patterning स्टैंसिल जगह है.
  3. डिवाइस के अच्छी तरह से और नीचे चैनल के लिए सेल मीडिया जोड़ें.
  4. बीज HUVECs 40,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर अच्छी तरह से।
    नोट: इस घनत्व पर एचयूवीईसी आम तौर पर इनक्यूबेशन16,19के 24 घंटे के बाद एक संगम मोनोलेयर बनाते हैं।
  5. डिवाइस को पेट्री डिश में रखें। स्थानीय आर्द्रता बनाए रखने के लिए पेट्री डिश में डीआई पानी के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब टोपी जोड़ें।
  6. पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    नोट: डिवाइस के शीर्ष अच्छी तरह से और नीचे चैनल में सेल मीडिया हर 24 घंटे बदला जाना चाहिए. नीचे चैनल में मीडिया को बदलने के लिए, पुराने मीडिया को दूसरे पोर्ट से विस्थापित करने के लिए बंदरगाहों में से एक में ताजा मीडिया को धीरे से इंजेक्ट करें।

6. माइक्रोफ्लुइडिक मोड में पुनर्विन्यास

  1. ऊपरी आवास, कम आवास, प्रवाह मॉड्यूल, जलाशयों, ट्यूबों, और विधानसभा से पहले 30 मिनट के लिए एक यूवी नसबंदी कक्ष में रखकर सुझावों वितरण बाँझ. प्रवाह सर्किट में 70% इथेनॉल और फिर बाँझ पीबीएस प्रसारित करें।
  2. एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडिया के साथ जलाशयों और ट्यूबों को भरें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. नमूना चरण पर निचले आवास रखें। निचले आवास में ओपन-वेल कोर मॉड्यूल डालें।
  4. मॉड्यूल के कुएं से सेल मीडिया को एस्पिरेट करें। अच्छी तरह से प्रवाह मॉड्यूल रखें.
  5. कोर मॉड्यूल में प्रवाह मॉड्यूल को अच्छी तरह से सील करने के लिए ऊपरी आवास रखें। इनलेट और आउटलेट वितरण युक्तियों को प्रवाह मॉड्यूल बंदरगाहों से कनेक्ट करें।
  6. सिस्टम में द्रव प्रवाह शुरू करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप शुरू करें।

7. प्रवाह परिचय के बाद ओपन-वेल प्रारूप में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण का संचालन करना

नोट: यहां संस्कृति का समय प्रयोगात्मक लक्ष्यों पर निर्भर करता है। उपयोगकर्ता अपनी पसंद के आधार पर ओपन-वेल या माइक्रोफ्लुइडिक प्रारूपों में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, आरएनए निष्कर्षण) का संचालन कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यदि एक खुली अच्छी तरह से प्रारूप पसंद किया जाता है, प्रणाली मानक प्रोटोकॉल16,19 के आधार पर परख का संचालन करने के लिए पुन: कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए.

  1. कतरनी प्रवाह जोखिम के लिए वांछित समय तक पहुँच गया है जब पंप बंद करो. इनलेट और आउटलेट वितरण युक्तियों को हटा दें।
  2. ऊपरी आवास को हटा दें। धीरे चिमटी का उपयोग कर अच्छी तरह से प्रवाह मॉड्यूल को हटा दें.
  3. अच्छी तरह से सेल मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें। मानक प्रोटोकॉल के आधार पर वांछित परख का संचालन करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ओपन-वेल कोर मॉड्यूल शुरू में एक कम आवास और एक कवरस्लिप द्वारा बनाई गई एक विशिष्ट गुहा के भीतर स्थित है, जैसा कि चित्रा 6 ए में दिखाया गया है। इसके बाद, प्रवाह मॉड्यूल, जिसमें एक माइक्रोचैनल और एक्सेस पोर्ट शामिल हैं, को कोर मॉड्यूल के कुएं में डाला जाता है। प्रवाह मॉड्यूल को निचले और ऊपरी आवासों में एम्बेडेड मैग्नेट के बीच चुंबकीय आकर्षण बल के कारण झिल्ली की सिलिकॉन समर्थन परत के खिलाफ सुरक्षित रूप से सील कर दिया जाता है, जैसा कि चित्र 6बी में दर्शाया गया है। इस चुंबकीय लैचिंग तंत्र की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, एक फट दबाव परीक्षण आयोजित किया गया था, जिसमें प्रदर्शित किया गया था कि सिस्टम 38.8 ± 2.4 kPa तक के मृत-समाप्त दबावों का सामना कर सकता है। यह दबाव सहिष्णुता सेल संस्कृति अनुप्रयोगों में आने वाले विशिष्ट ऑपरेटिंग दबावों से काफी अधिक है। इसके अलावा, सिस्टम लीक से मुक्त रहता है जब 4000 माइक्रोन/मिनट तक की प्रवाह दर के अधीन होता है, जो संस्कृति क्षेत्र16 में 74 डायन/सेमी2 के कतरनी तनाव के बराबर होता है।

जब एक मंच है कि खुले अच्छी तरह से और microfluidic मोड के बीच स्विच कर सकते हैं विकसित, सावधान विचार आम तौर पर पारंपरिक स्थिर खुली अच्छी तरह से प्लेटफार्मों16 के लिए एक चिंता का विषय नहीं है जो सेल बोने दृष्टिकोण के लिए दिया जाना चाहिए. चैनल सीमा के आसपास मोनोलेयर को नुकसान प्रयोगात्मक परिणाम20 में जटिलताओं का परिचय दे सकता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक हटाने योग्य स्टैंसिल डिजाइन किया गया था जो कोर मॉड्यूल के खुले कुएं के भीतर फिट बैठता है और कोशिकाओं को झिल्ली की सतह (चित्रा 3)पर अधिमानतः व्यवस्थित करने के लिए एक विशिष्ट खिड़की प्रदान करता है। एक बार सेल मोनोलेयर पैटर्न किया जाता है और संगम तक पहुंचता है, उपयोगकर्ता के पास ओपन-वेल प्रारूप में प्रयोग जारी रखने या सेल मोनोलेयर को शारीरिक कतरनी तनाव(चित्रा 3)को उजागर करने के लिए प्लेटफॉर्म को माइक्रोफ्लुइडिक मोड में पुन: कॉन्फ़िगर करने का लचीलापन होता है। चुंबकीय लैचिंग तंत्र आवश्यकतानुसार ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक प्रारूपों के बीच आसानी से स्विच करने की क्षमता प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, डिवाइस एक प्रवाह उत्तेजना के बाद खुली अच्छी तरह से प्रारूप में वापस आ सकता है, उपयोगकर्ताओं को मानक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल15,16 का उपयोग कर परखों (जैसे इम्यूनोस्टेनिंग, शाही सेना निष्कर्षण, और आणविक पारगम्यता माप) की एक किस्म का संचालन करने के लिए लचीलापन की पेशकश.

मानव शरीर की शारीरिक सेटिंग में, संवहनी बाधा प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के संपर्क में है, जो एक प्रमुख बायोफिजिकल क्यू के रूप में कार्य करता है जो बाधा 5,21,22की संरचना और कार्य को प्रभावित करता है। इस प्रकार, माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में द्रव प्रवाह के अलावा एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। मंच की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करने के लिए, मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक ओपन-वेल प्रारूप में एक एचयूवीईसी मोनोलेयर स्थापित किया गया था। स्थैतिक संस्कृति के 24 घंटे के बाद, मंच को 24 घंटे के लिए सेल मोनोलेयर को 10.7 डायन/सेमी2 कतरनी तनाव में उजागर करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मोड में पुन: कॉन्फ़िगर किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि प्रवाह दिशा के साथ गठबंधन प्रवाह के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं जबकि प्रवाह के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से उन्मुख(चित्रा 8ए,बी)बने रहे. कतरनी उत्तेजना के बाद, मंच को मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरएनए निकालने के लिए ओपन-वेल प्रारूप में पुन: कॉन्फ़िगर किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि कतरनी तनाव के लिए कोशिकाओं के संपर्क में क्रुपेल जैसे कारक 2 (केएलएफ 2) और एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (ईएनओएस) का उन्नयन हुआ, जो स्वस्थ रक्त वाहिकाओं23,24(चित्रा 8सी)में एंटी-थ्रोम्बोटिक और एथेरोप्रोटेक्टिव कार्यों जैसी महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो संवहनी बाधा मॉडल की तुलना। (ए) पारंपरिक ट्रांसवेल जैसे आवेषण और (बी) ओपन-वेल एम-माइक्रोसिम का योजनाबद्ध चित्रण। एक संगम HUVEC मोनोलेयर के ब्राइट-फील्ड छवियां ट्रैक-नक़्क़ाशीदार झिल्ली और एक अल्ट्राथिन नैनोमेम्ब्रेन के बीच उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग गुणवत्ता में अंतर को उजागर करती हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: निर्णय लेने का प्रवाह चार्ट। प्रयोगात्मक जरूरतों और बहाव विश्लेषण वरीयताओं के आधार पर एक प्रवाह चार्ट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मंच के प्रायोगिक कार्यप्रवाह। (ए) सीधे झरझरा झिल्ली पर कोशिकाओं की स्थिति के लिए, कोर मॉड्यूल के कुएं में एक हटाने योग्य पैटर्निंग स्टैंसिल डाला जाता है (इनसेट पैटर्न वाली कोशिकाओं को दिखाता है, पीली रेखाएं माइक्रोचैनल सीमाओं को प्रदर्शित करती हैं)। (बी) स्टैंसिल को स्थिर सेल संस्कृति के लिए डिवाइस में रखा या हटाया जा सकता है। (सी) प्लेटफॉर्म को माइक्रोफ्लुइडिक मोड में फिर से कॉन्फ़िगर करने के लिए, स्टैंसिल को फ्लो मॉड्यूल से बदल दिया जाता है। चुंबकीय सीलिंग तंत्र के कारण, कॉन्फ़िगरेशन प्रतिवर्ती है; हाउसिंग और फ्लो मॉड्यूल को ओपन-वेल मोड में स्विच करने के लिए हटाया जा सकता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन. मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नए नए साँचे का योजनाबद्ध चित्रण। (ए) स्टैंसिल मोल्ड। (बी) लेजर कट एक्रिलिक शीट। (सी) स्टैंसिल मोल्ड का इकट्ठे दृश्य। (डी) प्रवाह मॉड्यूल मोल्ड। (ई) लेजर कट एक्रिलिक शीट। (एफ) प्रवाह मॉड्यूल मोल्ड का इकट्ठे दृश्य। त्रिभुज के आकार की विशेषताएं सांचों को ऐक्रेलिक शीट संलग्न करने की सुविधा के लिए संरेखण चिह्न हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: तिपतिया घास के आकार प्रवाह मॉड्यूल के योजनाबद्ध। (ए) प्रवाह मॉड्यूल और झिल्ली चिप के बीच संपर्क इंटरफ़ेस। द्रव प्रवाह के लिए इनलेट और आउटलेट पोर्ट गुलाबी रंग में दिखाए गए हैं। (बी) पीडीएमएस प्रवाह मॉड्यूल की 3 डी छवि। मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: डिवाइस पुनर्विन्यास के लिए चुंबकीय विधानसभा। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक मोड में डिवाइस पुनर्विन्यास के लिए घटकों का योजनाबद्ध प्रदर्शन। विपरीत ध्रुवों के साथ एम्बेडेड मैग्नेट सीलिंग के लिए आकर्षण पैदा करते हैं। (बी) गुलाबी रंग में संवहनी चैनल और हरे रंग में ऊतक डिब्बे दिखा पुन: कॉन्फ़िगर डिवाइस के पार अनुभागीय दृश्य. मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रवाह सर्किट का इकट्ठे दृश्य। सर्किट में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, सेल मीडिया की आपूर्ति के लिए दो जलाशय होते हैं और उतार-चढ़ाव, टयूबिंग, और घटकों को जगह में रखने के लिए एक ऐक्रेलिक चरण होता है। मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: खुले-कुएं और माइक्रोफ्लुइडिक मोड में सुसंस्कृत एचयूवीईसी की तुलना। कोशिकाओं को एक संगम मोनोलेयर स्थापित करने के लिए 24 घंटे के लिए खुले कुएं में बीज और सुसंस्कृत किया गया था। बाद के 24 घंटे की अवधि के दौरान, उपकरणों के एक सेट को माइक्रोफ्लुइडिक मोड में पुन: कॉन्फ़िगर किया गया था। (ए) प्रवाह के तहत सुसंस्कृत कोशिकाएं (10.7 dynes.cm-2 कतरनी तनाव) प्रवाह दिशा के साथ संरेखित (इनसेट क्रमशः हरे और नीले रंग में कोशिकाओं के एक्टिन और नाभिक दिखाता है)। (बी) खुली अच्छी तरह से प्रारूप में प्रवाह के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं ने कोई संरेखण नहीं दिखाया। रडार भूखंडों में सलाखों की लंबाई संबंधित दिशा में कोशिकाओं की संख्या को दर्शाती है। (सी) प्रवाह के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं ने नो-फ्लो स्थिति (** पी < 0.01, एन = 3, मतलब ± एसडी) की तुलना में केएलएफ 2 और ईएनओएस जीन के उच्च अपरेगुलेशन को दिखाया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. मंसूरी एट अल.16 से अनुकूलित। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: विभिन्न प्रवाह दरों पर नैनोमेम्ब्रेन सतह पर कतरनी तनाव। यह तालिका विभिन्न प्रवाह दरों पर नैनोमेम्ब्रेन सतह पर कतरनी तनाव मूल्यों के बारे में जानकारी प्रदान करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: स्टैंसिल मोल्ड का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: स्टैंसिल मोल्ड के लिए लेजर कट गुहाओं का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: प्रवाह मॉड्यूल का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: प्रवाह मॉड्यूल मोल्ड के लिए लेजर कट गुहाओं का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 5: ऊपरी आवास का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 6: निचले आवास का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 7: ऐक्रेलिक चरण का सीएडी मॉडल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक ultrathin nanomembrane विशेषता एक खुली अच्छी तरह से मंच में प्रवाह क्षमताओं को शामिल करने के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित करने के लिए है. इस डिजाइन में, एक चुंबकीय latching दृष्टिकोण प्रयोगों के दौरान खुले अच्छी तरह से और fluidic मोड के बीच स्विचन और दोनों दृष्टिकोण के फायदे के संयोजन की अनुमति देता है. पारंपरिक स्थायी रूप से बंधुआ प्लेटफार्मों के विपरीत, चुंबकीय latching प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह 16,25,26,27के दौरान सुविधाजनक बिंदुओं पर मंच जुदा किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इस मंच में, कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और बाधा परिचित खुली अच्छी तरह से प्रारूप में स्थापित किया गया है, और फिर प्रणाली बस एक प्रवाह मॉड्यूल जोड़ने और चुंबकीय यह सील द्वारा एक द्रव मोड के लिए पुन: कॉन्फ़िगर किया गया है. यह पुनर्विन्यास दो प्रमुख लाभ प्रदान करता है: पहला, यह सेल मोनोलेयर को द्रव-प्रेरित कतरनी तनाव को उजागर करके शारीरिक स्थितियों के अनुकरण को सक्षम बनाता है; दूसरा, यह प्रवाह की स्थिति16 के तहत प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तरह माध्यमिक घटकों की शुरूआत की सुविधा. चुंबकीय लैचिंग सुविधा एक टूल-फ्री असेंबली विधि प्रदान करती है, जो ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक प्रारूपों के बीच ऑन-डिमांड स्विचिंग को सक्षम करती है। नतीजतन, ऐसे immunocytochemistry और शाही सेना निष्कर्षण के रूप में बहाव विश्लेषण, मानक तकनीकों का उपयोग कर या वांछित16 के रूप में microfluidic तकनीक का उपयोग कर परिचित खुली अच्छी तरह से प्रारूप में आयोजित किया जा सकता है.

चुंबकीय सीलिंग डिजाइन का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो प्लेटफॉर्म की पुन: विन्यास क्षमता को सक्षम बनाता है, और इस प्रकार, इसके सटीक कार्य के लिए कई विचारों की आवश्यकता होती है: (1) निचले आवास की ऊंचाई कोर मॉड्यूल की ऊंचाई से मेल खाना चाहिए (सहिष्णुता: ±0.1 मिमी) मॉड्यूल को ठीक से संलग्न करने के लिए। (2) प्रवाह मॉड्यूल की ऊंचाई कोर मॉड्यूल (0-0.1 मिमी) के कुएं से थोड़ी लंबी होनी चाहिए। (3) यह डिज़ाइन सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुकूल है और यह अनिवार्य नहीं है कि प्रवाह मॉड्यूल का निर्माण इलास्टोमेरिक सामग्री से किया जाए। महत्वपूर्ण तत्व एक विश्वसनीय सील स्थापित करने के लिए प्रवाह मॉड्यूल और झिल्ली चिप के बीच इंटरफेस में एक नरम, गैसकेट जैसी सामग्री को शामिल करना है। (4) प्रेस-फिटिंग मैग्नेट के लिए आवासों में लेजर-कट गुहाओं का व्यास28 इस्तेमाल किए गए उपकरण के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। मैग्नेट अलग हो सकते हैं और प्रवाह रिसाव का कारण बन सकते हैं यदि गुहा व्यास बहुत बड़ा है, या यदि गुहाएं बहुत छोटी हैं तो चुंबक सम्मिलन के दौरान आवास दरार हो सकते हैं। उपर्युक्त विचारों का पालन करके, यहां पेश किए गए चुंबकीय विधानसभा दृष्टिकोण को अन्य ओपन-वेल सिस्टम को माइक्रोफ्लुइडिक मोड में पुन: कॉन्फ़िगर करने के लिए लागू किया जा सकता है।

पुनर्विन्यास क्षमता है, यह झिल्ली सतह पर कोशिकाओं की सटीक स्थिति की अनुमति देता है कि एक patterning स्टैंसिल का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. स्टैंसिल सुनिश्चित करता है कि कोई भी कोशिका झरझरा संस्कृति क्षेत्र (यानी, सिलिकॉन समर्थन क्षेत्र पर) के बाहर नहीं है, जो प्रवाह मॉड्यूल के सम्मिलन पर क्षतिग्रस्त हो सकती है। यह पहलू सह-संस्कृति मॉडल में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है क्योंकि अनजाने में अनपेक्षित स्थानों में वरीयता प्राप्त कोशिकाएं बाधा ऊतक के विकास में सक्रिय रूप से भाग नहीं ले सकती हैं। बहरहाल, इन गलत कोशिकाओं को आमतौर पर लसीका प्रक्रिया के दौरान पुनः प्राप्त कर रहे हैं और संभावित रूप से जीन अभिव्यक्ति अध्ययन है कि झिल्ली20 भर में कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच में पूर्वाग्रह परिचय कर सकते हैं. स्टैंसिल का उपयोग कर खुली अच्छी तरह से सेल बोने पारंपरिक microfluidic प्लेटफार्मों 4,16 में निहित हैं जो प्रवाह पथ के साथ सेल नुकसान को कम करके बोने दक्षता को बढ़ाता है. यह मंच कई सेल प्रकारों और ईसीएम सामग्री 15,16,17को शामिल करने में भी सक्षम है। उदाहरण के लिए, ऊतक डिब्बे की नकल करने के लिए एक सेल-लेटे हुए हाइड्रोजेल को डिवाइस के निचले चैनल में इंजेक्ट किया जा सकता है, जबकि झिल्ली के शीर्ष पर एक एंडोथेलियम स्थापित किया जाता है।

यद्यपि चुंबकीय मॉड्यूल और घटकों का पुन: उपयोग किया जा सकता है, आवास में मैग्नेट के ढीले होने और सीलिंग बल को कम करने के कारण कई उपयोगों पर प्रभावी सीलिंग बनाए रखना एक मुद्दा हो सकता है। डिजाइन स्थापित होने के बाद इंजेक्शन मोल्डिंग या 3 डी प्रिंटिंग तकनीकों का उपयोग करके प्रत्येक प्रयोग या बड़े पैमाने पर उत्पादन घटकों के लिए नए टुकड़े टुकड़े वाले मॉड्यूल बनाकर इस समस्या को कम किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि में, प्रवाह मॉड्यूल को मैन्युअल रूप से कोर मॉड्यूल में रखा गया है, और सिस्टम की मल्टीप्लेक्सिंग और स्वचालन क्षमता सीमित है। प्रयोगात्मक थ्रूपुट में सुधार करने के लिए, प्रवाह मॉड्यूल और ऊपरी आवास को एक कार्यात्मक मॉड्यूल में एकीकृत किया जा सकता है जिसमें आंतरिक रूटिंग चैनल और मानकीकृत टयूबिंग कनेक्शन होते हैं जो एक साथ समानांतर में कई मॉड्यूल को छिड़कते हैं।

ओपन-वेल कोर मॉड्यूल के घटक बड़े पैमाने पर उत्पादित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। सिस्टम के अन्य घटक, जैसे प्रवाह मॉड्यूल, आवास और पैटर्निंग स्टैंसिल, को भी बड़े पैमाने पर गढ़ा जा सकता है। इसके अलावा, प्लेटफ़ॉर्म की पुन: विन्यास क्षमता वास्तविक समय उत्तेजना और माप के लिए सेंसर और एक्ट्यूएटर्स (जैसे, ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल प्रतिरोध मॉड्यूल, इलेक्ट्रोपोरेशन मॉड्यूल) को जोड़ने की अनुमति देती है। कुल मिलाकर, यह मंच इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं के बाहर व्यापक उपयोग का समर्थन करने में मदद करने के लिए पारंपरिक और माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोणों को जोड़ता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

जेएलएम SiMPore, Inc. के सह-संस्थापक हैं और कंपनी में इक्विटी हित रखते हैं। SiMpor इस अध्ययन में इस्तेमाल झिल्ली सहित ultrathin सिलिकॉन आधारित प्रौद्योगिकियों व्यावसायीकरण कर रहा है.

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 और एनएसएफ अनुदान सीबीईटी 2150798 के तहत वित्त पोषित किया गया था। लेखक एल्यूमीनियम मोल्ड निर्माण के लिए आरआईटी मशीन शॉप को धन्यवाद देते हैं। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes Langer Instruments WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex VWR 95039-090
1x PBS 7.4 pH ThermoFisher Scientific 10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP Jensen Global JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP Jensen Global JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) DigiKey 3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) DigiKey 3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin ThermoFisher Scientific A12379 
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g VWR AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet McMaster-Carr 8560K171 12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet McMaster-Carr 8589K31 12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet McMaster-Carr 8560K191 12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg Corning 47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm VWR 10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Fixture A1&A2 SiMPore Inc. NA
Fixture B1&B2 SiMPore Inc. NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor Thermo Fisher Scientific 4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) ThermoFisher Scientific C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) Thermo Fisher Scientific R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) K&J Magnetics D31 3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar Fisher Scientific aa47392-9M
Peristaltic Pump Langer Instruments BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution Fisher Scientific NC9901158
PVDF syringe filters PerkinElmer 2542913
Silicon wafer University wafer,USA 1196
SU-8 3050 Fisher Scientific NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) ThermoFisher Scientific 4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) ThermoFisher Scientific 4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) ThermoFisher Scientific 4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile VWR 100500-422
TRI-reagent ThermoFisher Scientific AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip SiMPore Inc. NPSN100-1L The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1 SiMPore Inc. NA
uSiM component 2 SiMPore Inc. NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
  2. Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
  3. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
  4. Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
  5. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  6. Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
  7. Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
  8. Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
  9. Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
  10. Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
  11. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  12. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
  13. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  14. Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
  15. McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
  16. Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
  17. Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
  18. Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
  19. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
  20. Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
  21. Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
  22. Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
  23. Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
  24. Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
  25. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
  26. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 204
गतिशील माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में स्टेटिक बैरियर ऊतक मॉडल को बदलना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mansouri, M., Hughes, A. R., Audi,… More

Mansouri, M., Hughes, A. R., Audi, L. A., Carter, A. E., Vidas, J. A., McGrath, J. L., Abhyankar, V. V. Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems. J. Vis. Exp. (204), e66090, doi:10.3791/66090 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter