Summary
Этот протокол описывает реконфигурируемую платформу клеточных культур на основе мембраны, которая объединяет формат открытой лунки с возможностями потока жидкости. Эта платформа совместима со стандартными протоколами и позволяет осуществлять обратимые переходы между режимами культивирования в открытых лунках и микрофлюидными культурами, удовлетворяя потребности как инженерных, так и бионаучных лабораторий.
Abstract
Микрофизиологические системы представляют собой миниатюрные платформы для клеточных культур, используемые для имитации структуры и функций тканей человека в лабораторных условиях. Тем не менее, эти платформы не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях, где мембранные подходы с открытыми лунками служат золотым стандартом для имитации тканевых барьеров, несмотря на отсутствие возможностей для потока жидкости. Эта проблема может быть связана, прежде всего, с несовместимостью существующих микрофизиологических систем со стандартными протоколами и инструментами, разработанными для систем с открытыми лунками.
В этой статье мы представляем протокол для создания реконфигурируемой мембранной платформы со структурой открытого ствола, возможностью увеличения потока и совместимостью с обычными протоколами. В этой системе используется подход магнитной сборки, который обеспечивает обратимое переключение между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом. При таком подходе пользователи могут начать эксперимент в формате открытой скважины с использованием стандартных протоколов и добавлять или удалять возможности потока по мере необходимости. Для демонстрации практического использования этой системы и ее совместимости со стандартными методиками был создан монослой эндотелиальных клеток в формате открытого лунки. Система была перенастроена для введения потока жидкости, а затем переведена в формат открытой лунки для проведения иммуноокрашивания и экстракции РНК. Благодаря совместимости с традиционными протоколами работы с открытыми скважинами и возможности увеличения потока, ожидается, что эта реконфигурируемая конструкция будет принята как инженерными, так и биологическими лабораториями.
Introduction
Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань 1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии 3,4.
Наиболее широко используемым подходом для таких моделей культивирования является конфигурация 5, подобная конфигурации «открытая скважина»5, в которой пористая мембрана для культивирования с трековым травлением разделяет заполненные средой отсеки (рис. 1A). В этом формате клетки могут быть засеяны с любой стороны мембраны, и был разработан широкий спектр экспериментальных протоколов. Тем не менее, эти системы ограничены в своей способности обеспечивать потоки жидкости, необходимые для поддержки созревания барьеров и имитации циркуляции иммунных клеток, наблюдаемой in vivo 5,6. Следовательно, они не могут быть использованы для исследований, требующих динамических потоков, которые вводят дозы лекарств, механическое раздражение или индуцированные жидкостью сдвиговые напряжения 6,7,8.
Для преодоления ограничений систем с открытыми скважинами были разработаны микрофлюидные платформы, сочетающие пористые мембраны культур с индивидуально адресуемыми флюидными каналами9. Эти платформы обеспечивают точный контроль над маршрутизацией жидкости, перфузией и введением химических соединений, контролируемой стимуляцией сдвига и возможностями динамического добавления клеток 7,10,11,12,13. Несмотря на расширенные возможности, предоставляемые микрофлюидными платформами, они не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях из-за сложных микрофлюидных протоколов и их несовместимости с установленными экспериментальными рабочими процессами 4,10,14.
Чтобы преодолеть разрыв между этими технологиями, мы представляем протокол, в котором используется магнитно реконфигурируемая модульная система. Эта система может легко переключаться между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом в зависимости от конкретных потребностей эксперимента. Платформа представляет собой устройство с открытой лункой, известное как m-μSiM (модульная микрофизиологическая система на основе кремниевой мембраны), с культуральной мембраной (наномембраной) толщиной 100 нм. Эта наномембрана обладает высокой пористостью (15%) и стеклоподобной прозрачностью, как показано на рисунке 1B. Он физически отделяет верхний отсек от нижнего канала, обеспечивая молекулярный транспорт по физиологическим шкалам длины15. В отличие от обычных трековых мембран, которые имеют известные проблемы при визуализации живых клеток с помощью визуализации в светлом поле, благоприятные оптические и физические свойства наномембраны позволяют четко визуализировать клетки по обе стороны поверхности мембраны 15,16,17.
В настоящем протоколе описывается изготовление специализированных модулей посева и потока, а также объясняется магнитная реконфигурация платформы. Он демонстрирует, как платформа может быть использована для создания эндотелиальных барьеров как в статических, так и в динамических условиях. Эта демонстрация показывает, что эндотелиальные клетки выстраиваются вдоль направления потока, с повышением регуляции чувствительных к сдвигу генов-мишеней при стимуляции сдвигом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данная конструкция может использоваться в различных режимах исходя из экспериментальных требований и предпочтений конечного пользователя. Перед каждым экспериментом сверяйтесь с блок-схемой принятия решений, представленной на рисунке 2 , чтобы определить необходимые шаги и модули для протокола. Например, если пользователь намерен поддерживать формат открытой лунки на протяжении всего эксперимента, чтобы напрямую сравнить его с системой типа Transwell, трафарет шаблона не требуется для засева клеток. Основной модуль коммерчески доступен (см. Таблицу материалов), а ультратонкая наномембрана может быть выбрана из библиотеки материалов с различной пористостью и размером пор в соответствии с экспериментальными потребностями.
1. Изготовление трафарета с рисунком
ПРИМЕЧАНИЕ: Трафарет с рисунком служит для позиционирования клеток исключительно на пористой области мембранного чипа, предотвращая оседание клеток на окружающем кремниевом слое, где они потенциально могут быть повреждены после добавления модуля потока16 (см. рис. 3). Повреждение монослоя может отрицательно сказаться на целостности барьера и поставить под угрозу результаты эксперимента. Трафарет не нужен в открытой, статичной культуре, так как отсутствует риск повреждения.
- Приобретите, обработайте или напечатайте на 3D-принтере пресс-форму, используя дизайн, представленный в Дополнительном файле кодирования 1 (Рисунок 4A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стенки трафарета сужаются, чтобы увеличить емкость носителя и свести к минимуму захват пузырьков по сравнению с прямыми стенками с высоким соотношением сторон. - Прикрепите самоклеящуюся пленку толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,2 мм с помощью холодного валика (см. Таблицу материалов).
- Лазерная резка акрилового листа в соответствии с дизайном, представленным в Дополнительном файле кодирования 2 , для создания массива полостей (Рисунок 4B).
- Снимите защитный слой с пленки PSA и приложите акриловый лист к форме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лист, вырезанный лазером, выровнен по отношению к пресс-форме так, чтобы элементы пресс-формы были центрированы в полости (Рисунок 4C). От этого шага зависит точность позиционирования клеток на мембране. - Тщательно перемешайте преполимер PDMS (используя соотношение оснований и катализаторов 10:1) (см. Таблицу материалов) и дегазируйте его в вакуумной камере до тех пор, пока не останется видимых пузырьков (5-15 минут).
- Медленно залейте ПДМС в полости формы, разравнивая ее ровным краем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить застревание пузырьков, медленно залейте PDMS в каждую полость. Если после заливки присутствуют пузырьки, поместите форму в вакуумную камеру и снова дегазируйте. - Отверждайте PDMS на конфорке при температуре 70 °C в течение 1 часа, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
- Извлеките трафареты из полостей формы с помощью пинцета с плоским наконечником.
2. Изготовление модуля потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный модуль имеет ту же площадь, что и клеверный колодец основного модуля, и включает в себя формованный микроканал (ширина = 1,5 мм, высота = 0,2 мм, длина = 5 мм). Форма клевера помогает выровнять канал по пористой области культуры (рис. 5).
- Используйте стандартные методы мягкой литографии18 для создания кремниевой формы с характеристиками, определенными конструкцией, представленной в дополнительном файле кодирования 3 (рисунок 4D).
- Прикрепите пленку PSA толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,2 мм.
- Лазерная резка акрилового листа на основе дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 4 , для создания массива полостей в форме клевера (Рисунок 4E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Высота полости определяет высоту проточного модуля, которая должна быть немного выше (на 0-0,1 мм), чем высота колодца основного модуля, чтобы обеспечить надлежащую герметизацию. - Снимите защитный слой с пленки PSA, а затем прикрепите вырезанный лазером лист к силиконовой форме, совместив треугольные метки выравнивания на силиконовой форме с метками на листе, вырезанном лазером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично шагу 1.4, убедитесь, что вырезанный лазером акриловый лист выровнен по силиконовой форме так, чтобы элементы пресс-формы были центрированы в каждой полости (Рисунок 4F). На этом шаге определяется положение микроканала относительно посадочного места. - Медленно вылейте дегазированный PDMS в полости формы и разровняйте его плоским краем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если после заливки присутствуют пузырьки, дегазируйте форму, пока пузырьки не будут удалены. - Поместите форму на конфорку и выпекайте PDMS при температуре 70 °C в течение 1 часа, затем дайте форме остыть до комнатной температуры.
- Осторожно извлеките модули потока из полостей пресс-формы с помощью пинцета с плоским наконечником.
- Сориентируйте модуль потока так, чтобы элементы микроканала были направлены вверх, и расположите впускные и выходные отверстия сердцевины в конце канала с помощью пробойника для биопсии (см. Таблицу материалов).
3. Изготовление нижнего и верхнего акриловых корпусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Основной модуль помещается в нижний корпус. Притяжение между встроенными магнитами в корпусах сжимает и уплотняет модуль потока к основному модулю (Рисунок 6).
- Вырежьте лазером акриловый лист толщиной 2 мм, используя дизайн, приведенный в Дополнительном файле кодирования 5 , чтобы создать верхний корпус с отверстиями для вставки магнита.
- Прикрепите пленку PSA толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,5 мм.
- Вырежьте акриловый лист лазером на основе дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 6 , чтобы создать нижний корпус с отверстиями для вставки магнита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина нижнего корпуса является критическим параметром и должна соответствовать общей толщине основного модуля, чтобы предотвратить утечку во время потока. - Снимите защитный слой PSA и прикрепите нижний корпус к стеклянному защитному стеклу.
- Запрессовать никелированные неодимовые магниты диаметром 4,75 мм (см. таблицу материалов) в вырезанные лазером отверстия корпусов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что магниты в нижнем и верхнем корпусах расположены с противоположной полярностью, чтобы обеспечить магнитное притяжение (Рисунок 6).
4. Изготовление проточного контура
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный контур с замкнутым контуром содержит две пробирки для сбора проб в качестве резервуаров (Рисунок 7). Входной резервуар оснащен фильтром из поливинилидендифторида (PVDF), который позволяет клеточной среде уравновешиваться с концентрациейCO2 в инкубаторе.
- Используйте пуансон для биопсии диаметром 1 мм, чтобы создать два отверстия в крышке флакона для сбора образцов.
- С помощью пробойников для биопсии создайте два отверстия (1 мм и 4 мм) в крышке отдельного флакона для сбора образцов и создайте отверстие 1 мм в нижней части этого флакона.
- Вставьте дозирующие наконечники по 20 г в каждое из отверстий диаметром 1 мм и заклейте их горячим клеем.
- Поместите фильтр PVDF 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) в отверстие диаметром 4 мм и заклейте его горячим клеем.
- Лазерная резка акрилового листа толщиной 1,5 мм с использованием дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 7 , для создания этапа выдержки образца.
- Расположите резервуары на акриловой сцене.
- Подсоедините дозирующие наконечники с помощью микропроточных трубок (см. Таблицу материалов).
- Соедините трубки с входным и выходным отверстиями модуля потока с помощью дозирующих наконечников 21 G.
- Используйте перистальтический насос (см. Таблицу материалов) для циркуляции потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании для подачи потока также можно использовать шприц или пневматические насосы. Расход должен определяться исходя из экспериментальных потребностей. Полная таблица, полученная на основе экспериментально проверенной модели COMSOL, приведена в Дополнительной таблице 1 , чтобы помочь пользователям выбрать необходимую скорость потока для достижения желаемого напряжения сдвига в монослое ячейки16.
5. Посев клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с обычными мембранными вставками, на наномембране можно культивировать различные типы клеток. Вторичный тип клеток также может быть совместно культивирован на другой стороне мембраны в нижнем канале15.
- Покройте мембрану 5 мкг/см2 фибронектина (см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 1 ч для улучшения прикрепления клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный тип ячейки может повлиять на требуемое покрытие и плотность ячеек. Процедура, описанная здесь, предназначена для эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC, см. Таблицу материалов). - Аспирируйте раствор покрытия с помощью пипетки P200 и поместите трафарет с рисунком в лунку модуля сердечника.
- Добавьте ячеистую среду в лунку и нижний канал устройства.
- Высевают HUVEC с плотностью 40 000 клеток/см2 в лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC при такой плотности обычно образуют сливающийся монослой после 24 ч инкубации16,19. - Поместите прибор в чашку Петри. Добавьте в чашку Петри коническую крышку пробирки объемом 15 мл с деионизированной водой для поддержания локальной влажности.
- Перенесите чашку Петри в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные среды в верхнем колодце и нижнем канале устройства следует менять каждые 24 часа. Чтобы заменить фильтрующий материал в нижнем канале, осторожно введите свежий носитель в один из портов, чтобы вытеснить старый носитель из другого порта.
6. Перенастройка в микрофлюидный режим
- Перед сборкой простерилизуйте верхний корпус, нижний корпус, проточный модуль, резервуары, пробирки и дозирующие наконечники, поместив их в УФ-стерилизационную камеру на 30 минут. Циркулируйте 70% этанол, а затем стерильный PBS в проточном контуре.
- Заполните резервуары и пробирки средой для выращивания эндотелиальных клеток (см. таблицу материалов).
- Поместите нижний корпус на предметный столик. Вставьте модуль сердечника с открытым колодцем в нижний корпус.
- Отсасывайте клеточную среду из лунки модуля. Поместите модуль потока в колодец.
- Поместите верхний корпус, чтобы уплотнить модуль потока в колодце основного модуля. Подсоедините впускной и выпускной дозирующие наконечники к портам модуля потока.
- Запустите перистальтический насос, чтобы ввести поток жидкости в систему.
7. Проведение последующего анализа в формате открытой скважины после ввода потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования здесь зависит от целей эксперимента. Пользователи могут проводить последующий анализ (например, иммуноцитохимию, экстракцию РНК) либо в открытом луночном формате, либо в микрофлюидном формате в зависимости от своих предпочтений. Например, если предпочтительный формат открытой скважины, система должна быть перенастроена для проведения анализов на основе стандартных протоколов16,19.
- Остановите насос по достижении желаемого времени воздействия сдвигового потока. Снимите впускной и выпускной дозирующие наконечники.
- Снимите верхний корпус. Аккуратно извлеките модуль потока из колодца с помощью пинцета.
- Добавьте в лунку 100 мкл клеточной среды. Проведение желаемых анализов на основе стандартных протоколов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модуль керна открытого колодца первоначально размещается в специальной полости, образованной нижним корпусом и покровным стеклом, как показано на рисунке 6A. Затем модуль потока, включающий в себя микроканал и порты доступа, вставляется в лунку основного модуля. Модуль потока надежно прилегает к кремниевому опорному слою мембраны за счет силы магнитного притяжения между магнитами, встроенными в нижний и верхний корпуса, как показано на рисунке 6B. Для оценки эффективности этого механизма магнитной фиксации было проведено испытание на разрывное давление, продемонстрировавшее, что система может выдерживать тупиковые давления до 38,8 ± 2,4 кПа. Этот допуск к давлению значительно превышает типичное рабочее давление, встречающееся при работе с клеточными культурами. Кроме того, система не допускает утечек при воздействии скорости потока до 4000 мкл/мин, что эквивалентно напряжению сдвига 74 дин/см2 в области культивирования16.
При разработке платформы, которая может переключаться между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом, необходимо тщательно рассмотреть подход к засеиванию клеток, который обычно не является проблемой для обычных статических платформ с открытой скважиной16. Повреждение монослоя вокруг границы канала может привести к осложнениям в результатах экспериментов20. Для решения этой проблемы был разработан съемный трафарет, который помещается в открытую лунку основного модуля и обеспечивает определенное окно для предпочтительного оседания клеток на поверхности мембраны (рис. 3). После того, как монослой ячейки сформирован и достигает слияния, пользователь может продолжить эксперимент в формате открытой лунки или перенастроить платформу в микрофлюидный режим, чтобы подвергнуть монослой клетки физиологическому напряжению сдвига (рис. 3). Магнитный механизм фиксации обеспечивает возможность легкого переключения между форматами с открытой скважиной и микрофлюидными форматами по мере необходимости. Например, устройство может быть возвращено к формату открытой лунки после стимуляции потока, предлагая пользователям гибкость для проведения различных анализов (таких как иммуноокрашивание, экстракция РНК и измерение молекулярной проницаемости) с использованием стандартных экспериментальных протоколов15,16.
В физиологических условиях человеческого организма сосудистый барьер подвергается индуцированному потоком сдвиговому напряжению, которое служит ключевым биофизическим сигналом, влияющим на структуру и функцию барьера 5,21,22. Таким образом, добавление потока жидкости в микрофизиологические системы является ключевым требованием. Для демонстрации универсальности платформы был установлен монопласт HUVEC в формате открытого колодца с использованием стандартных протоколов. После 24 часов статического культивирования платформа была перенастроена в микрофлюидный режим, чтобы подвергнуть монослой клетки напряжению сдвига 10,7 дин/см2 в течение 24 часов. Результаты показали, что клетки, культивируемые под потоком, выравнивались по направлению потока, в то время как клетки, культивируемые без потока, оставались случайно ориентированными (рис. 8A, B). После стимуляции сдвига платформа была перенастроена на формат открытой лунки для извлечения РНК по стандартным протоколам. Результаты показали, что воздействие на клетки сдвигового стресса привело к повышению регуляции круппель-подобного фактора 2 (KLF2) и эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), которые выполняют важнейшие роли, такие как антитромботические и атеропротекторные функции в здоровых кровеносных сосудах23,24 (рис. 8C).
Рисунок 1: Сравнение моделей сосудистого барьера in vitro . Схематическое изображение (A) обычных Transwell-подобных вставок и (B) открытой лунки m-μSiM. Светлопольные изображения сливающегося монослоя HUVEC подчеркивают разницу в качестве изображения в светлом поле между трековой мембраной и ультратонкой наномембраной. Масштабные линейки = 100 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Блок-схема принятия решений. Блок-схема, основанная на экспериментальных потребностях и предпочтениях последующего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспериментальный рабочий процесс платформы. (A) Для непосредственного позиционирования клеток на пористой мембране в лунку основного модуля вставляется съемный трафарет с рисунком (на врезке показаны узорчатые ячейки, желтые линии демонстрируют границы микроканалов). (B) Трафарет можно хранить или извлекать в устройстве для статической клеточной культуры. (C) Для перенастройки платформы в микрофлюидный режим трафарет заменяется модулем потока. Благодаря механизму магнитного уплотнения конфигурация является обратимой; Корпуса и модуль расхода могут быть сняты для переключения в режим открытого колодца. Масштабная линейка = 200 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схематическое изображение пресс-форм. (А) Трафаретная форма. (B) Акриловый лист, вырезанный лазером. (C) Собранный вид трафаретной формы. (D) Пресс-форма для модуля потока. (E) Акриловый лист, вырезанный лазером. (F) Собранный вид пресс-формы модуля потока. Элементы треугольной формы являются метками выравнивания для облегчения крепления акриловых листов к формам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Схема модуля потока в форме клевера. (A) Контактный интерфейс между модулем потока и мембранным чипом. Впускные и выпускные отверстия для потока жидкости показаны розовым цветом. (B) 3D-изображение модуля потока PDMS. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Магнитный узел для реконфигурации устройства. (A) Схематическая демонстрация компонентов для перенастройки устройства в микрофлюидный режим. Встроенные магниты с противоположными полюсами вызывают притяжение для уплотнения. (B) Вид в поперечном сечении реконфигурированного устройства, показывающий сосудистый канал розовым цветом и тканевый отсек зеленым цветом. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Собранный вид проточного контура. Контур состоит из перистальтического насоса, двух резервуаров для подачи ячеистой среды и демпфирования колебаний, трубки и акриловой ступени для удержания компонентов на месте. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Сравнение HUVEC, культивируемых в открытом и микрофлюидном режимах. Клетки высевали и культивировали в открытом лунке в течение 24 ч для создания сливающегося монослоя. В течение последующих 24 часов один комплект устройств был перенастроен в микрофлюидный режим. (A) Клетки, культивируемые под действием потока (напряжение сдвига 10,7 dynes.cm-2 ), выровненные вдоль направления потока (на врезке актин и ядра клеток показаны зеленым и синим цветом соответственно). (B) Клетки, культивируемые без потока в формате открытых лунок, не показали выравнивания. Длина столбцов на радиолокационных графиках показывает количество ячеек в соответствующем направлении. (C) Клетки, культивируемые под потоком, показали более высокую регуляцию генов KLF2 и eNOS по сравнению с состоянием отсутствия потока (**p < 0,01, n = 3, среднее ± SD). Масштабные линейки = 100 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Напряжение сдвига на поверхности наномембраны при различных скоростях потока. В этой таблице приведена информация о значениях напряжения сдвига на поверхности наномембраны при различных скоростях потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 1: CAD-модель трафаретной формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 2: CAD-модель полостей лазерной резки для трафаретной формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 3: CAD-модель модуля потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 4: CAD-модель полостей лазерной резки для пресс-формы модуля потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 5: CAD-модель верхнего корпуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 6: CAD-модель нижнего корпуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кодирования 7: CAD-модель акрилового столика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью данного протокола является разработка практического метода включения возможностей потока в открытую платформу с ультратонкой наномембраной. В данной конструкции используется магнитная фиксация, позволяющая переключаться между открытым и флюидным режимами во время экспериментов и сочетать преимущества обоих подходов. В отличие от обычных стационарно скрепленных платформ, магнитная фиксация позволяет разбирать платформу в удобных точках во время экспериментального рабочего процесса 16,25,26,27. На этой платформе ячейки засеиваются, и барьер устанавливается в привычном формате открытого колодца, а затем система перенастраивается в жидкостный режим путем простого добавления модуля потока и его магнитной герметизации. Такая реконфигурация дает два ключевых преимущества: во-первых, она позволяет моделировать физиологические условия, подвергая монослой клетки напряжению сдвига, индуцированному жидкостью; Во-вторых, он облегчает внедрение вторичных компонентов, таких как иммунные клетки, в условиях потока16. Функция магнитной фиксации позволяет выполнять сборку без использования инструментов, что позволяет по требованию переключаться между форматами с открытыми лунками и микрофлюидными форматами. Следовательно, последующие анализы, такие как иммуноцитохимия и экстракция РНК, могут проводиться в привычном формате открытой лунки с использованием стандартных методов или с использованием микрофлюидных методовпо желанию 16.
Магнитное уплотнение является критическим параметром конструкции, который обеспечивает реконфигурацию платформы, и, таким образом, для ее точного функционирования требуется несколько соображений: (1) Высота нижнего корпуса должна соответствовать высоте основного модуля (допуск: ±0,1 мм), чтобы модуль был правильно закрыт. (2) Высота модуля расхода должна быть немного выше, чем высота лунки основного модуля (0-0,1 мм). (3) Эта конструкция может быть адаптирована к широкому спектру материалов и не требует, чтобы модуль потока был изготовлен из эластомерных материалов. Решающим элементом является использование мягкого, похожего на прокладку материала на границе раздела между проточным модулем и мембранной стружкой для обеспечения надежного уплотнения. (4) Диаметр вырезанных лазером полостей в корпусах пресс-фитингов магнитов должен быть оптимизирован в зависимости от используемого прибора28. Магниты могут отсоединиться и привести к утечке потока, если диаметр полости слишком велик, или корпуса могут треснуть во время установки магнита, если полости слишком малы. Следуя вышеупомянутым соображениям, подход магнитной сборки, представленный здесь, может быть применен для перенастройки других систем с открытым колодцем в микрофлюидный режим.
Чтобы иметь возможность реконфигурации, необходимо использовать трафарет для нанесения рисунка, который позволяет точно позиционировать клетки на поверхности мембраны. Трафарет гарантирует, что клетки не находятся за пределами пористой области культуры (т. е. на кремниевой подложке), которые могут быть повреждены при введении проточного модуля. Этот аспект становится особенно важным в моделях совместного культивирования, потому что клетки, непреднамеренно засеянные в непредусмотренных местах, не могут активно участвовать в развитии барьерной ткани. Тем не менее, эти неправильно расположенные клетки обычно извлекаются в процессе лизиса и потенциально могут внести смещение в исследования экспрессии генов, которые изучают взаимодействия между клетками через мембрану20. Засев ячеек в открытых лунках с использованием трафарета повышает эффективность посева за счет снижения потерь в ячейках на пути потока, которые присущи обычным микрофлюидным платформам 4,16. Эта платформа также способна включать в себя несколько типов ячеек и материалов ECM 15,16,17. Например, в нижний канал устройства может быть введен нагруженный клетками гидрогель, чтобы имитировать тканевый компартмент, в то время как эндотелий устанавливается поверх мембраны.
Несмотря на то, что магнитные модули и компоненты могут быть использованы повторно, поддержание эффективной герметизации в течение нескольких применений может быть проблемой из-за ослабления магнитов в корпусе и уменьшения усилия уплотнения. Эту проблему можно смягчить, изготавливая новые ламинированные модули для каждого эксперимента или массово производя компоненты с использованием технологий литья под давлением или 3D-печати после того, как дизайн уже разработан. В методе, описанном в этом протоколе, модуль потока вручную помещается в основной модуль, а возможности мультиплексирования и автоматизации системы ограничены. Для повышения производительности экспериментов проточный модуль и верхний корпус могут быть объединены в один функциональный модуль, содержащий внутренние каналы маршрутизации и стандартизированные соединения трубок, которые одновременно выполняют несколько модулей параллельно.
Компоненты кернового модуля открытого ствола производятся серийно и имеются в продаже. Другие компоненты системы, такие как модуль потока, корпуса и трафарет для нанесения рисунков, также могут быть изготовлены в больших масштабах. Кроме того, реконфигурируемость платформы позволяет добавлять датчики и исполнительные механизмы (например, модуль трансэндотелиального электрического сопротивления, модуль электропорации) для стимуляции и измерений в режиме реального времени. В целом, эта платформа сочетает в себе традиционный и микрофлюидный подходы для поддержки широкого использования за пределами инженерных лабораторий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. является соучредителем SiMPore, Inc. и владеет долей в уставном капитале компании. SiMPore коммерциализирует ультратонкие технологии на основе кремния, включая мембраны, используемые в этом исследовании.
Acknowledgments
Это исследование было частично профинансировано Национальным институтом здравоохранения в рамках грантов R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 и гранта NSF CBET 2150798. Авторы благодарят RIT Machine Shop за изготовление алюминиевых форм. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
