Her præsenteres en detaljeret protokol til isolering og karakterisering af knoglemarvsmikromiljøpopulationer fra murine modeller af myelodysplastiske syndromer og akut myeloid leukæmi. Denne teknik identificerer ændringer i den ikke-hæmatopoietiske knoglemarvsniche, herunder endotel- og mesenkymale stromale celler, med sygdomsprogression.
Knoglemarvsmikromiljøet består af forskellige cellepopulationer, såsom mesenkymale stromale celler, endotelceller, osteolineageceller og fibroblaster, som yder støtte til hæmatopoietiske stamceller (HSC’er). Ud over at understøtte normale HSC’er spiller knoglemarvsmikromiljøet også en rolle i udviklingen af hæmatopoietiske stamcelleforstyrrelser, såsom myelodysplastiske syndromer (MDS) og akut myeloid leukæmi (AML). MDS-associerede mutationer i HSC’er fører til en blokering i differentiering og progressiv knoglemarvssvigt, især hos ældre. MDS kan ofte udvikle sig til behandlingsresistent AML, en sygdom karakteriseret ved en hurtig ophobning af umodne myeloide blaster. Knoglemarvsmikromiljøet vides at være ændret hos patienter med disse myeloide neoplasmer. Her beskrives en omfattende protokol til isolering og fænotypisk karakterisering af knoglemarvsmikromiljøceller fra murinmodeller af myelodysplastisk syndrom og akut myeloid leukæmi. Isolering og karakterisering af ændringer i knoglemarvsnichepopulationerne kan hjælpe med at bestemme deres rolle i sygdomsinitiering og progression og kan føre til udvikling af nye lægemidler rettet mod kræftfremmende ændringer i knoglemarvstromale populationer.
Knoglemarvsmikromiljøet består af hæmatopoietiske celler, ikke-hæmatopoietiske stromale celler og den ekstracellulære matrix 1,2. Dette mikromiljø kan fremme hæmatopoietisk stamcelle selvfornyelse, regulere afstamningsdifferentiering og give strukturel og mekanisk støtte til knoglevævet 1,2,3,4,5. Den stromale niche omfatter osteolineageceller, fibroblaster, nerveceller og endotelceller6, mens den hæmatopoietiske niche består af lymfoide og myeloide populationer 1,2,3. Ud over at understøtte normale HSC’er kan knoglemarvsmikromiljøet også spille en rolle i udviklingen af hæmatopoietiske stamcelleforstyrrelser såsom MDS og AML 7,8,9,10,11. Mutationer i osteolineageceller har vist sig at fremme udviklingen af MDS, AML og andre myeloproliferative neoplasmer 10,12,13,14.
Myelodysplastiske syndromer er en gruppe af præ-leukæmiske lidelser, der opstår som følge af mutationer i hæmatopoietiske stamceller. MDS er ofte forbundet med en blok i HSC-differentiering og produktion af dysplastiske celler, hvilket ofte kan føre til knoglemarvssvigt. MDS er den mest almindeligt diagnosticerede myeloide neoplasma i USA og er forbundet med en 3-årig overlevelsesrate på 35% -45%15. MDS er ofte forbundet med en høj risiko for transformation til akut myeloid leukæmi. Dette kan være en fatal komplikation, da MDS-afledt AML er resistent over for de fleste behandlinger og sandsynligvis vil komme tilbage. AML, der opstår de novo på grund af translokationer eller mutationer i hæmatopoietisk stamme og forfædre, er også ofte resistent over for standard kemoterapi16,17. Da MDS og AML primært er sygdomme hos ældre, hvor størstedelen diagnosticeres over 60 år, er de fleste patienter ikke berettiget til helbredende knoglemarvstransplantationer. Der er således et betydeligt behov for at identificere nye regulatorer for sygdomsprogression. Da knoglemarvsmikromiljøet kan yde støtte til maligne celler14, kan definition af ændringer i knoglemarvsnichen med sygdomsprogression føre til identifikation af nye terapier med det formål at hæmme tumornicheremodellering. Der er derfor et betydeligt behov for at identificere nye regulatorer for sygdomsprogression. Til dette formål er det afgørende at identificere og karakterisere ændringer i knoglemarvens stromale cellepopulationer, der kan yde støtte til de ondartede celler.
Der er genereret flere murine modeller af AML og MDS, som kan bruges til at studere ændringer i knoglemarvsmikromiljøet under sygdomsinitiering og progression 6,1,19,20,21,22. Her beskrives protokoller til identifikation af ændringer i knoglemarvsstromale cellepopulationer ved hjælp af murine modeller af retroviralt induceret AML 6,20 samt den kommercielt tilgængelige Nup98-HoxD13 (NHD13) model af højrisiko-MDS til AML-transformation19. Mus, transplanteret med de novo AML-celler, bukker under for sygdommen på 20-30 dage6. NHD13-musene udvikler cytopenier og knoglemarvsdysplasi omkring 15-20 uger, som til sidst omdannes til AML, og næsten 75% af musene bukker under for sygdommen omkring 32 uger. For at analysere murine model knoglemarv mikromiljø populationer, knogler høstes, knoglemarv og knogle spicules fordøjes ved hjælp af enzymatisk fordøjelse, og cellerne er derefter beriget for CD45-/Ter119- ikke-hæmatopoietiske populationer ved magnetisk sortering. Mens lignende analyser tidligere er beskrevet 11,13,22,23,24,25, fokuserer de ofte på enten knoglemarven eller knoglen og inkorporerer ikke celler fra begge kilder i deres analyser. Den kombinerede karakterisering af disse populationer sammen med genekspressionsanalyser kan give en omfattende forståelse af, hvordan det cellulære hæmatopoietiske mikromiljø giver støtte til sygdomsinitiering og progression (figur 1). Mens protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på retroviralt induceret AML-model og en genetisk MDS-model, kan disse strategier let tilpasses til at studere ændringer i knoglemarvsnichen i enhver murinmodel af interesse.
Murine leukæmi modeller er blevet flittigt anvendt til at identificere celle iboende og niche-drevne signaler, der fremmer aggressiv myeloid leukæmi progression 6,19,21. Her præsenteres en omfattende flowcytometribaseret protokol til definition af den cellulære sammensætning af knoglemarvsmikromiljøet i murine modeller af MDS og AML.
Før du erhverver flowcytometriske data fra eksperimentelle pr…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke URMC Flow Cytometry Core. Dette arbejde blev støttet af American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award og NIH tilskud R01DK133131 og R01CA266617 tildelt JB
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |