骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定
Summary
ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。
Abstract
骨髄微小環境は、間葉系間質細胞、内皮細胞、骨系細胞、線維芽細胞などの異なる細胞集団で構成されており、造血幹細胞(HSC)を支えています。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、骨髄異形成症候群(MDS)や急性骨髄性白血病(AML)などの造血幹細胞障害の発症にも関与しています。造血幹細胞におけるMDS関連変異は、特に高齢者において、分化不全および進行性骨髄不全を引き起こす。MDSは、未熟な骨髄芽球の急速な蓄積を特徴とする疾患である治療抵抗性AMLに進行することがよくあります。骨髄微小環境は、これらの骨髄性腫瘍の患者で変化することが知られています。ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境細胞を単離し、表現型的に特徴付けるための包括的なプロトコルが説明されています。骨髄ニッチ集団における変化を単離し、特徴づけることは、疾患の開始と進行におけるそれらの役割を決定するのに役立ち、骨髄間質集団における癌を促進する変化を標的とする新しい治療法の開発につながる可能性があります。
Introduction
骨髄微小環境は、造血細胞、非造血間質細胞、および細胞外マトリックスからなる1,2。この微小環境は、造血幹細胞の自己複製を促進し、系統分化を調節し、骨組織に構造的および機械的支持を提供することができる1,2,3,4,5。間質ニッチには、骨系細胞、線維芽細胞、神経細胞、および内皮細胞6が含まれ、造血ニッチは、リンパ系および骨髄系集団1,2,3からなる。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、MDSやAML 7,8,9,10,11などの造血幹細胞疾患の発症にも役割を果たす可能性があります。骨系細胞の変異は、MDS、AML、およびその他の骨髄増殖性腫瘍の発症を促進することが示されています10,12,13,14。
骨髄異形成症候群は、造血幹細胞の突然変異から生じる前白血病疾患のグループです。MDSは、造血幹細胞の分化や異形成細胞の産生のブロックと関連していることが多く、骨髄不全につながることがよくあります。MDSは、米国で最も一般的に診断される骨髄性腫瘍であり、35%〜45%の3年生存率と関連しています15。MDSは、急性骨髄性白血病への形質転換のリスクが高いことと関連していることが多い。MDS由来のAMLはほとんどの治療法に耐性があり、再発する可能性が高いため、これは致命的な合併症になる可能性があります。造血幹および前駆細胞の転座または変異によりde novoで発生するAMLも、標準的な化学療法に耐性を示すことが多い16,17。MDSとAMLは主に高齢者の疾患であり、大多数が60歳以上と診断されているため、ほとんどの患者は根治的骨髄移植に不適格です。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて大きい。骨髄微小環境は悪性細胞14を支持することができるので、疾患の進行に伴う骨髄ニッチの変化を定義することは、腫瘍ニッチのリモデリングを阻害することを目的とした新規治療薬の同定につながり得る。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて高い。この目的のためには、悪性細胞を支持する可能性のある骨髄間質細胞集団の変化を特定し、特徴付けることが重要です。
AMLおよびMDSのいくつかのマウスモデルが生成されており、疾患の開始および進行中の骨髄微小環境の変化を研究するために使用できます6,1,19,20,21,22。ここでは、レトロウイルス誘発性AML 6,20のマウスモデル、ならびに高リスクMDSからAMLへの形質転換19の市販のNup98-HoxD13(NHD13)モデルを用いて、骨髄間質細胞集団の変化を同定するプロトコルが記載されている。de novoAML細胞を移植したマウスは、20〜30日でこの病気に屈します6。NHD13マウスは、15〜20週頃に血球減少症と骨髄異形成を発症し、最終的にAMLに変化し、マウスの約75%が32週頃にこの病気に屈します。マウスモデルの骨髄微小環境集団を解析するために、骨を採取し、骨髄と骨棘を酵素消化を用いて消化し、次に磁気選別によって細胞をCD45-/Ter119-非造血集団のために濃縮します。同様の分析は以前にも報告されていますが11,13,22,23,24,25、それらはしばしば骨髄または骨のいずれかに焦点を当てており、両方のソースからの細胞を分析に組み込んでいません。これらの集団の特性評価と遺伝子発現解析を組み合わせることで、細胞造血微小環境が疾患の開始と進行をどのようにサポートするかを包括的に理解することができます(図1)。以下に説明するプロトコルは、レトロウイルス誘発性AMLモデルと遺伝的MDSモデルに焦点を当てていますが、これらの戦略は、関心のあるマウスモデルの骨髄ニッチの変化を研究するために簡単に適応させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス白血病モデルは、侵攻性骨髄性白血病の進行を促進する細胞内因性およびニッチ主導のシグナルを特定するために広く使用されています6,19,21。ここでは、MDSおよびAMLのマウスモデルにおける骨髄微小環境の細胞組成を定義するための包括的なフローサイトメトリーベースのプロトコルが提示されます。
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
URMCフローサイトメトリーコアに感謝します。この研究は、米国血液学会奨学生賞、白血病研究財団賞、およびJ.B.に授与されたNIH助成金R01DK133131およびR01CA266617の支援を受けました。
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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