זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה
Summary
כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.
Abstract
מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.
Introduction
המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3. בנוסף לתמיכה ב-HSCs נורמליים, מיקרו-סביבה של מח העצם יכולה גם למלא תפקיד בהתפתחות של הפרעות תאי גזע המטופויטיים כגון MDS ו-AML 7,8,9,10,11. מוטציות בתאי אוסטאו-שושלת הוכחו כמקדמות התפתחות של MDS, AML וגידולים מיאלופרוליפרטיביים אחרים 10,12,13,14.
תסמונות מיאלודיספלסטיות הן קבוצה של הפרעות טרום לוקמיות הנובעות ממוטציות בתאי גזע המטופויטיים. MDS קשור לעתים קרובות עם בלוק בהתמיינות HSC וייצור של תאים דיספלסטיים, אשר לעתים קרובות יכול להוביל לאי ספיקת מח עצם. MDS הוא הניאופלזמה המיאלואידית המאובחנת הנפוצה ביותר בארצות הברית והוא קשור לשיעור הישרדות של 3 שנים של 35%-45%15. MDS קשור לעתים קרובות עם סיכון גבוה של טרנספורמציה לוקמיה מיאלואידית חריפה. זה יכול להיות סיבוך קטלני, שכן AML נגזר MDS עמיד לרוב הטיפולים וסביר להניח להישנות. AML המתעורר דה נובו עקב טרנסלוקציות או מוטציות בגזע hematopoietic ואבות הוא גם עמיד לעתים קרובות כימותרפיה סטנדרטית16,17. מכיוון ש- MDS ו- AML הן בעיקר מחלות של קשישים, כאשר רובם מאובחנים מעל גיל 60 שנה, רוב החולים אינם כשירים להשתלת מח עצם מרפאת. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. מכיוון שהמיקרו-סביבה של מח העצם יכולה לספק תמיכה לתאים ממאירים14, הגדרת שינויים בנישת מח העצם עם התקדמות המחלה עשויה להוביל לזיהוי טיפולים חדשניים שמטרתם לעכב עיצוב מחדש של נישת הגידול. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. לשם כך, קריטי לזהות ולאפיין שינויים באוכלוסיית תאי הסטרומה של מח העצם שעשויים לספק תמיכה לתאים הממאירים.
מספר מודלים של AML ו- MDS נוצרו וניתן להשתמש בהם כדי לחקור שינויים במיקרו-סביבה של מח העצם במהלך התחלת המחלה והתקדמותה 6,1,19,20,21,22. כאן, מתוארים פרוטוקולים לזיהוי שינויים באוכלוסיית תאי סטרומה של מח העצם באמצעות מודלים מורינים של AML 6,20 המושרה רטרו-ויראלית, כמו גם מודל Nup98-HoxD13 (NHD13) הזמין מסחרית של MDS בסיכון גבוה לשינוי AML19. עכברים שהושתלו בהם תאי AML דה נובו נכנעים למחלה תוך 20-30 יום6. עכברי NHD13 מפתחים ציטופניה ודיספלסיה של מח עצם בסביבות 15-20 שבועות, אשר בסופו של דבר הופכת ל-AML, וכמעט 75% מהעכברים נכנעים למחלה בסביבות 32 שבועות. כדי לנתח את אוכלוסיות המיקרו-סביבה של מח עצם מודל מורין, עצמות נקצרות, מח עצם וקוצים עצם מתעכלים באמצעות עיכול אנזימטי, ולאחר מכן התאים מועשרים עבור CD45-/Ter119- אוכלוסיות שאינן המטופויטיות על ידי מיון מגנטי. בעוד שניתוחים דומים תוארו בעבר 11,13,22,23,24,25, הם מתמקדים לעתים קרובות במח העצם או בעצם ואינם משלבים תאים משני המקורות בניתוחים שלהם. האפיון המשולב של האוכלוסיות האלה, בשילוב עם ניתוחי ביטוי גנים, יכול לספק הבנה מקיפה של האופן שבו המיקרו-סביבה ההמטופויטית התאית מספקת תמיכה להתחלת מחלות והתקדמותן (איור 1). בעוד שהפרוטוקול המתואר להלן מתמקד במודל AML המושרה רטרו-ויראלית ובמודל MDS גנטי, ניתן להתאים אסטרטגיות אלה בקלות לחקר שינויים בנישת מח העצם של כל מודל מורין מעניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג’יי.בי.
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
