양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화
Summary
위 환자 유래 오가노이드는 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있지만, 표준화된 파종 밀도를 가진 단일 세포 분해물에서 인간 위 오가노이드를 생성하기 위한 공식적인 프로토콜은 부족합니다. 이 프로토콜은 상부 내시경 검사 중에 얻은 생검 조직에서 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 자세한 방법을 제시합니다.
Abstract
위 환자 유래 오가노이드(PDO)는 위 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 고유한 도구를 제공합니다. 결과적으로 이러한 PDO는 다양한 연구 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 표준화된 초기 세포 파종 밀도를 유지하면서 단일 세포 분해물에서 위 PDO를 생산하기 위한 공개된 접근법이 부족합니다. 이 프로토콜에서는 분리된 단일 세포에서 위 오가노이드를 시작하고 단편화를 통해 오가노이드를 통과시키는 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 초기 세포 파종 밀도에 대한 표준화된 접근 방식이 양성 생검 조직에서 일관되게 위 오가노이드를 생성하고 오가노이드 성장의 표준화된 정량화를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 증거는 위 PDO가 오가노이드가 신체의 생검에서 유래했는지 또는 위의 전방 영역에서 유래했는지에 따라 다양한 형성 및 성장 속도를 나타낸다는 새로운 관찰을 뒷받침합니다. 특히, 오가노이드 개시를 위해 전방 생검 조직을 사용하면 위체의 생검에서 생성된 오가노이드와 비교할 때 20일 동안 더 많은 수의 오가노이드가 형성되고 더 빠른 오가노이드 성장이 발생하는 것으로 나타났습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 연구자에게 위 PDO를 성공적으로 생성하고 작업하기 위한 시기적절하고 재현 가능한 방법을 제공한다.
Introduction
오가노이드는 1,2에서 파생된 장기의 구조와 기능을 닮은 소형 3차원(3D) 세포 구조입니다. 이러한 실험실 성장 모델은 줄기 세포 또는 조직 특이적 세포를 통제된 환경에서 배양하여 생성되며, 이를 통해 세포가 다양한 세포 유형으로 자체 조직화되고 분화할 수 있습니다 1,2,3. 오가노이드의 주요 장점 중 하나는 기존의 2차원(2D) 세포 배양보다 인간 생물학을 더 면밀히 재현할 수 있다는 것입니다 1,2,3. 특히, 인간 오가노이드는 기원 조직의 유전적 다양성을 유지하는 것으로 나타났습니다 3,4,5. 오가노이드는 통제된 실험실 환경에서 인간 장기 발달을 연구하고, 질병을 모델링하고, 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 또한 오가노이드는 개별 환자 샘플에서 파생될 수 있으므로 맞춤형 의학 접근법과 개별화된 치료법의 잠재적 개발이 가능합니다 3,6,7.
연구원들은 인간 위 오가노이드를 사용하여 위 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 조사했습니다. 대표적인 예로는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 사용하여 위암 화학요법 반응을 예측하고8,9,10 헬 리코박터 파일로리 감염에 대한 상피 반응을 모델링하는 것을 들 수 있다 11,12,13. 인간 위 오가노이드는 목 세포, 구덩이 세포 및 기타 지원 세포를 포함하여 위에서 발견되는 다양한 세포 유형으로 구성됩니다11,14. 위 오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 생검을 통해 얻은 위 조직으로부터 직접 분리된 줄기세포나 위 절제술 표본으로부터 생성될 수 있다11,14. 위 조직으로부터 위 줄기 세포를 분리하는 것은 일반적으로 위선을 분리 및 배양하거나 단일 세포를 방출하기 위해 조직 샘플을 효소로 소화함으로써 수행된다 9,13,15. 중요한 것은 이러한 기술 중 하나를 사용하여 생성된 위 오가노이드 내 세포의 분화가 유사한 것으로 나타났다는 것입니다13. 본원에 기술된 프로토콜은 단일-세포 분해에 초점을 맞춘다.
오가노이드는 전통적인 세포 배양과 전체 장기 사이의 격차를 해소하는 과학적 혁신을 나타냅니다. 이 분야의 연구가 계속 진행됨에 따라 오가노이드는 광범위한 응용 분야에서 보다 효과적인 치료법 및 치료법 개발에 기여할 준비가 되어 있습니다. 위 PDO의 활용도가 높아짐에 따라 PDO 생성에 대한 표준화된 접근 방식이 시의적절하게 필요합니다. 여기에서, 상부 내시경 동안 획득된 양성 위 생검 조직으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 PDO를 생성하기 위한 프로토콜이 설명된다. 중요하고 독특하게도, 위 PDO를 안정적으로 생성하고 후속 특성 분석을 허용하기 위해 파종에 대해 표준화된 수의 단일 세포가 결정됩니다. 이 기술을 사용하여 위체 또는 위 안반의 생검에서 생성된 오가노이드의 형성 및 성장에 대한 신뢰할 수 있는 차이를 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 위체 및 antrum의 양성 상피의 생검으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 오가노이드를 신뢰성 있게 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 개략적으로 설명된다. 프로토콜의 중요한 단계는 타이밍과 기저 멤브레인 매트릭스 처리와 관련이 있습니다. 생존력을 보존하려면 생검 조직을 획득한 후 가능한 한 빨리 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 목표는 생검 후 30분 이내에 생검 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
펜실베니아 대학교 게놈 의학 T32 HG009495(KHB), NCI R21 CA267949(BWK), BRCA Basser Center for BRCA의 남성 및 BRCA 프로그램(KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award(BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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