Summary
Mide hastası kaynaklı organoidler araştırmalarda giderek artan bir kullanım alanı bulmaktadır, ancak standartlaştırılmış tohumlama yoğunluğuna sahip tek hücreli sindirimlerden insan mide organoidleri üretmek için resmi protokoller eksiktir. Bu protokol, üst endoskopi sırasında elde edilen biyopsi dokusundan gastrik organoidlerin güvenilir bir şekilde oluşturulması için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Abstract
Mide hastası kaynaklı organoidler (PDO'lar), mide biyolojisi ve patolojisini incelemek için benzersiz bir araç sunar. Sonuç olarak, bu PDO'lar çok çeşitli araştırma uygulamalarında artan bir kullanım alanı bulmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış bir başlangıç hücre tohumlama yoğunluğunu korurken, tek hücreli sindirimlerden gastrik PDO'lar üretmek için yayınlanmış yaklaşımların eksikliği vardır. Bu protokolde, izole edilmiş tek hücrelerden mide organoidlerinin başlatılması ve organoidlerin parçalanma yoluyla geçirilmesi için bir yöntemin sağlanması üzerinde durulmaktadır. Daha da önemlisi, protokol, ilk hücre tohumlama yoğunluğuna standartlaştırılmış bir yaklaşımın, iyi huylu biyopsi dokusundan tutarlı bir şekilde gastrik organoidler verdiğini ve organoid büyümesinin standartlaştırılmış nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir. Son olarak, kanıtlar, gastrik PDO'ların, organoidlerin vücudun biyopsilerinden mi yoksa midenin antral bölgelerinden mi kaynaklandığına bağlı olarak değişen oluşum ve büyüme oranları gösterdiğine dair yeni gözlemi desteklemektedir. Spesifik olarak, organoid başlatma için antral biyopsi dokusunun kullanılmasının, mide gövdesinin biyopsilerinden üretilen organoidlere kıyasla 20 günlük bir süre boyunca daha fazla sayıda organoid oluşumu ve daha hızlı organoid büyümesi ile sonuçlandığı ortaya konmuştur. Burada açıklanan protokol, araştırmacılara gastrik PDO'ları başarılı bir şekilde oluşturmak ve bunlarla çalışmak için zamanında ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.
Introduction
Organoidler, türetildikleri organların mimarisine ve işlevselliğine benzeyen minyatür üç boyutlu (3D) hücresel yapılardır 1,2. Laboratuvarda yetiştirilen bu modeller, kök hücrelerin veya dokuya özgü hücrelerin, bu hücrelerin kendi kendini organize etmesine ve çeşitli hücre tiplerine farklılaşmasına izin veren kontrollü bir ortamda yetiştirilmesiyle oluşturulur 1,2,3. Organoidlerin en önemli avantajlarından biri, insan biyolojisini geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürlerindendaha yakından özetleme yetenekleridir 1,2,3. Özellikle, insan organoidlerinin orijin dokularının genetik çeşitliliğini koruduğu gösterilmiştir 3,4,5. Organoidler, kontrollü bir laboratuvar ortamında insan organı gelişimini incelemek, hastalıkları modellemek ve potansiyel terapötikleri test etmek için eşsiz bir fırsat sunar. Ayrıca, organoidler bireysel hasta örneklerinden elde edilebilir, bu da kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarına ve bireyselleştirilmiş tedavilerin potansiyel olarak geliştirilmesine olanak tanır 3,6,7.
Araştırmacılar, mide biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini araştırmak için insan mide organoidlerini kullandılar. Öne çıkan örnekler arasında mide kanseri kemoterapi yanıtlarınıtahmin etmek için hasta kaynaklı organoidlerin (PDO'lar) kullanımı 8,9,10 ve Helicobacter pylori enfeksiyonunaepitelyal yanıtı modellemek 11,12,13 yer alır. İnsan mide organoidleri, boyun hücreleri, çukur hücreleri ve diğer destekleyici hücreler dahil olmak üzere midede bulunan çeşitli hücre tiplerinden oluşur11,14. Gastrik organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) veya biyopsiler yoluyla elde edilen mide dokusundan veya gastrik rezeksiyon örneklerinden doğrudan izole edilen kök hücrelerdenüretilebilir 11,14. Mide kök hücrelerinin mide dokusundan izolasyonu yaygın olarak mide bezlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi veya tek hücreleri serbest bırakmak için doku örneklerinin enzimatik olarak sindirilmesiyle yapılır 9,13,15. Önemli olarak, bu tekniklerden herhangi biri kullanılarak üretilen mide organoidleri içindeki hücrelerin farklılaşmasının benzer olduğu gösterilmiştir13. Burada açıklanan protokol, tek hücreli bir özete odaklanır.
Organoidler, geleneksel hücre kültürü ile tüm organlar arasındaki boşluğu dolduran bilimsel bir yeniliği temsil eder. Alandaki araştırmalar ilerlemeye devam ettikçe, organoidler çok çeşitli uygulamalar için daha etkili tedavilerin ve terapilerin geliştirilmesine katkıda bulunmaya hazırdır. Gastrik PDO'ların artan kullanımı göz önüne alındığında, bunların üretilmesi için standart bir yaklaşıma zamanında ihtiyaç vardır. Burada, üst endoskopi sırasında elde edilen iyi huylu gastrik biyopsi dokusundan izole edilen tek hücrelerden insan gastrik PDO'larının üretilmesi için protokol açıklanmaktadır. Önemli ve benzersiz bir şekilde, gastrik PDO'ları güvenilir bir şekilde oluşturmak ve sonraki karakterizasyona izin vermek için tohumlama için standartlaştırılmış sayıda tek hücre belirlenir. Bu teknik kullanılarak, mide gövdesi veya mide antrumunun biyopsilerinden üretilen organoidlerin oluşumu ve büyümesinde güvenilir farklılıklar gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm insan dokusu, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #842961) tarafından onaylanan bir mide dokusu toplama çalışması yoluyla doku toplanması için bilgilendirilmiş onam veren kişilerden toplanmıştır. Bu çalışmaya katılanların rutin bakımlarının bir parçası olarak üst endoskopi yaptırmaları, en az 18 yaşında olmaları ve bilgilendirilmiş onam verebilmeleri gerekiyordu. Yapılan tüm araştırmalar, Pennsylvania Üniversitesi tarafından belirlenen yönergelere bağlı kalmıştır.
1. Deneysel hazırlık
- Şartlandırılmış L-WRN ortamını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın16. Zorunlu olmamakla birlikte, şartlandırılmış ortamda bulunan Wnt-3A, R-spondin ve noggin konsantrasyonları, üreticinin talimatları izlenerek ticari olarak temin edilebilen bir ELISA kitleri kullanılarak kontrol edilebilir (bkz.
- RPMI-Antibiyotikler (RPMI-ABX), PBS-Antibiyotikler (PBS-ABX), PBS-Ditiothreitol (PBS-DTT), sindirim tamponu ve mide organoid ortamını hazırlayın (ayrıntılı kompozisyon için Ek Tablo 1'e bakın). Gastrik organoid media 4 °C'de 1 hafta stabildir.
- Otoklav forsepsleri, ince diseksiyon makasları ve 1.5 mL tüpler.
- Bazal membran matrisini (Matrigel) buz üzerinde çözmeye başlayın.
- Sindirim tamponunu ve Tripsin-EDTA'yı 37 °C'lik bir su banyosunda çözmeye başlayın.
- Bir inkübatör orbital çalkalayıcıyı 37 °C ve 200 rpm'ye ayarlayın.
2. Biyopsi dokusundan tek hücrelerin izole edilmesi
- Muhtemelen jumbo forseps kullanımını içeren kurumsal klinik protokolü takiben bir üst endoskopi17 sırasında mide biyopsileri toplayın. Forsepsten doku örneklerini çıkarmak için künt uçlu bir iğne kullanın ve bunları RPMI-ABX ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Laboratuvara hızlı transfer için tüpü buz üzerinde tutun.
NOT: En az 2-4 biyopsi alınmalıdır. - Biyopsi dokusunun konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Ortamı aspire etmek için bir pipet kullanın ve biyopsileri 1 mL PBS-ABX tamponu ile iki kez yıkayın. Doku parçaları konik tüpe doğal olarak yerleştiği için santrifüjlemeye gerek yoktur.
- Minimum 20 mg biyopsi dokusunu 1 mL PBS-DTT içeren 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Dokuyu 1-2 mm veya daha küçük parçalara ayırmak için ince diseksiyon makası kullanın.
- Tüpün dibindeki doku parçalarını toplamak ve mümkün olduğunca fazla süpernatanı aspire etmek için 15 saniye boyunca bir masa üstü mini santrifüj kullanın. Küçük bir kalıntı PBS-DTT hacmi kabul edilebilir.
- 50 mL'lik konik bir tüpe 5 mL taze ısıtılmış sindirim tamponu ekleyin. Küçük doku parçalarını doku kaybetmeden transfer etmek için 500 μL sindirim tamponu alın ve dokuyu içeren 1.5 mL'lik tüpe ekleyin. Daha sonra, ucun çapını artırmak için 1000 μL'lik bir pipet ucunun ucunu makasla değiştirin, bu da doku parçalarının kolay aspirasyona ve sindirim tamponunu içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarılmasına olanak tanır.
- Sindirim tamponunu ve doku karışımını 37 °C'de 30 dakika boyunca 200 rpm'de orbital çalkalama ile inkübe edin.
- Sindirim tamponuna %0.25 EDTA ile 5 mL ısıtılmış tripsin ekleyin ve 200 rpm'de yörünge çalkalama ile 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
- Eşit hacimde Gelişmiş (Adv.) DMEM/F12 ortamı ekleyerek sindirim tamponunu ve tripsini nötralize edin ve çözeltiyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
- Hücreleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 1400 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Biyopsi dokusunun başlangıç boyutuna bağlı olarak, küçük bir hücre peleti görülebilir veya görünmeyebilir.
- Hücre peletini 1 mL Adv. DMEM / F12 ortamı ve Tripan Blue ve bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın.
- Hücreleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 1400 x g'da santrifüjleme yoluyla tekrar pelet edin ve süpernatanı çıkarın.
NOT: Şekil 1 , biyopsi dokusundan tek hücreleri izole etme işleminin şematik bir temsilini sunmaktadır.
3. Tek hücrelerin bir bazal membran matrisi "kubbesine" gömülmesi
- Sayılan canlı hücre sayısına bağlı olarak, 50 μL bazal membran matrisi başına 105 canlı hücrenin nihai konsantrasyonunu elde etmek için gereken bazal membran matrisinin hacmini hesaplayın.
- Kaplamadan önce bazal membran matrisinin polimerleşmesini önlemek için aşağıdakileri hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Çözülmüş bazal membran matrisini buzdan çıkarın, önceden hesaplanan bazal membran matrisi hacmini hücrelere ekleyin ve yaklaşık 10 saniye boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
NOT: Bu adımda baloncuk oluşturmaktan kaçınmak çok önemlidir. Bazal membran matrisini seyreltmeyin. - Bazal membran matrisi/hücre karışımının 50 μL'lik alikotlarını, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasındaki tek tek oyukların merkezine hızla pipetleyin.
- 24 oyuklu plakayı hemen kapatın ve tek bir yumuşak hareketle plakayı baş aşağı çevirin. Bazal membran matrisinin polimerize olmasını sağlamak için ters çevrilmiş plakayı 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne 35 dakika yerleştirin.
NOT: Hücrelerin plakanın dibine batmasını önlemek ve bazal membran matrisinin 3D "kubbe" şeklinde polimerleşmesini sağlamak için plakanın ters çevrilmesi önemlidir. - Her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış gastrik organoid ortam ekleyin ve her bir "kubbenin" üst kısmının ortama tamamen daldırılmasını sağlayın. "Kubbeyi" rahatsız etmemek için medyayı her kuyunun kenarına dağıtın.
- Medyayı 2-3 günde bir değiştirin.
4. Organoidlerin parçalanma yoluyla rutin geçişi
- Organoidler pasaja hazır olduğunda, ortamı belirlenen her kuyudan çıkarın.
NOT: Geçiş için uygun zamanı belirlemek için lütfen Temsili Sonuçlar bölümüne bakın. - 1 mL buz gibi Adv. DMEM/F12 ortamını doğrudan bir bazal membran matrisi "kubbesi" üzerine dağıtın. Bu, "kubbenin" parçalanmasını kolayca başlatmalıdır. "Kubbenin" tüm parçaları plakadan ayrılana kadar aspire etmeye ve dağıtmaya devam edin.
- Hem ortamı hem de parçalanmış bazal membran matrisini bir sonraki kuyuya taşıyın ve bu işlemi geçiş için planlanan tüm kuyular için tekrarlayın. Son bazal membran matrisini "kubbe" söktükten sonra, ortamı ve organoidler ve bazal membran matrisi karışımını 1,5 mL'lik bir tüpe dağıtın.
- P1000 pipete 1000 μL'lik bir uç takın ve ardından bu ucu 200 μL'lik bir uca yerleştirin. Bu, organoidleri parçalamak için yeterince küçük çaplı bir pipet ucu oluştururken, yine de daha büyük bir hacmin aspirasyonuna izin verecektir.
- Organoidleri küçük parçalara ayırmak için organoidler ve bazal membran matrisi karışımını yaklaşık 25 kez yukarı ve aşağı kuvvetlice pipetleyin.
- Parçalanmış organoid karışımı, 2000 x g'da 30 saniye boyunca 4 ° C'de bir masa üstü santrifüj kullanarak santrifüjleyin. Bu, bazal membran matrisinden ve ortamdan ayrılmış parçalanmış organoidlerin bir peleti ile sonuçlanacaktır. Ortamı ve bazal membran matris süpernatantını aspire etmek için bir pipet kullanın. Pelet gevşek olduğu için süpernatanı aspire etmek için vakum kullanmayın.
- Kuyu/kubbe sayısının 1:2 oranında (50 μL/kubbe) bölünmesi için gereken yeni çözülmüş bazal membran matrisinin hacmini hesaplayın. Taze bazal membran matrisini ekleyin ve kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Organoid fragmanları ve bazal membran matrisi karışımının 50 μL'sini 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına hızlı bir şekilde ayırın.
- Plakayı örtün, ters çevirin ve bazal membran matrisinin polimerize olmasını sağlamak için 35 dakika boyunca 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Her oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış gastrik organoid media ekleyin.
NOT: Şekil 2 , mide hastası kaynaklı organoidlerin parçalanma yoluyla geçişine şematik bir genel bakış sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha sonraki temsili sonuçlar, üst endoskopi yapılan beş farklı hastanın midelerinin hem mide gövdesinin hem de gastrik antrum bölgelerinin iyi huylu epitelinden alınan biyopsilerden elde edilir. Hem mide gövdesi hem de antrum biyopsileri için hasta başına iki ila dört "kubbe" / kuyucuk kaplandı ve analiz edildi. Organoidler, beş hastanın hepsinden mide gövdesi ve gastrik antrum biyopsi dokusundan başarıyla üretildi. Ortalama olarak, "kubbe" / kuyu başına 41 organoid analiz edildi. Tüm görüntüler, konfokal bir mikroskop kullanılarak elde edilen z-projeksiyonlarıdır ve organoid boyutunun ve küreselliğinin nicelleştirilmesi, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz.
Organoidler genellikle tek hücrelerin tohumlanmasından sonraki 10 gün içinde tanımlanabilir (Şekil 3A). 20. günde, organoidler büyüktür ve tipik olarak geçilmesi gerekir. Tek hücreli tohumlama sonrası oluşan organoidlerin sayısı biraz değişken olabilirken, vücut ve antral mide biyopsilerinden oluşan organoidlerin sayısı için beklenen sonuçlar Şekil 3B'de gösterilmektedir. Vücut ve antral organoidlerin sayısı, tohumlamadan sonraki 10. günde zirve yapar. Önemli olmamakla birlikte, toplam organoid sayısı 10. günden 15. güne ve 15. günden 20. güne düşmeye başlar. 10. günde oluşan ve daha sonra büyümeyi durduran ve sonraki 10 gün içinde ölen küçük organoidlerin bir alt popülasyonu var gibi görünüyor, bu da bu eğilimi açıklayacak. Önemli olarak, antral biyopsi dokusundan oluşan organoid sayısının, 10, 15 ve 20. günlerde vücuttan alınan biyopsi dokusundan anlamlı olarak daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Oluşan antral organoidlerin sayısı, vücuttan oluşan organoidlerin sayısından ortalama 2 kat daha fazlaydı.
Şekil 3C'de, 10. gün ile 20. gün arasında tek hücreli tohumlamadan sonra organoid büyümesi için temsili sonuçlar gösterilmektedir. Hem antral hem de vücut biyopsilerinden elde edilen organoidler 10. günden 20. güne kadar sabit bir büyüme görürken, antral biyopsi dokusundan üretilen organoidler, vücut biyopsi dokusundan üretilen organoidlere kıyasla daha yüksek bir büyüme oranı sergiledi. Özellikle, antral organoidler, 20. günde vücut organoidlerinden yaklaşık 4 kat daha büyük bir alana sahipti.
Farklı hastalar arasında, herhangi bir tek "kubbe" / kuyuda tipik olarak çeşitli organoid morfolojisi gözlenir (Şekil 4A). Bazı organoidler daha yuvarlak veya küreseldir, diğerleri ise daha düzensiz bir morfoloji sergiler. Bununla birlikte, ortalama olarak, bir organoidin ne kadar küresel olduğunun bir ölçümü olan küresellik (burada 1 = mükemmel bir küre puanı)18, vücut veya antral biyopsi dokusundan üretilen organoidler içinde ve arasında çok az varyasyon göstermiştir (Şekil 4B). Bu nedenle, farklı büyüme oranları olmasına rağmen, mide gövdesinin veya antrumun biyopsi dokusundan üretilen organoidler arasında tipik olarak önemli morfolojik farklılıklar yoktur.
Başlatmadan sonraki 20. günde, mide organoidleri tipik olarak geçişe hazırdır. Organoidin büyük bir organoid boyutu (≥1500 μm çapında) veya organoidin koyulaşmış bir iç kısmı (geniş hücresel döngüyü düşündürür), organoidlerin geçirilmesi gerektiğinin temel işaretleridir (Şekil 5A). Bu noktanın ötesine geçmek için bırakılan organoidler, geçtikten sonra organoidleri güvenilir bir şekilde yeniden oluşturmayan, belki de canlılık veya sap kaybına işaret eden 2D tek katmanlara (Şekil 5B) ayrılmaya başlayabilir. Burada açıklanan parçalanma protokolünü kullanarak mide organoidlerini geçirdikten ve yeniden tohumladıktan sonra, "kubbeler", kendilerini çok daha fazla organoid halinde yeniden düzenleyecek ve tek hücrelerin ilk tohumlanmasına kıyasla çok daha hızlı büyüyecek birçok organoid fragmanı (Şekil 5C) içerecektir (Şekil 5D). Organoid büyümesi, geçiş sırasında hala karakterizasyona ve / veya standardizasyona ihtiyaç duyuyorsa, mide organoidleri bunun yerine daha önce tarif edildiği gibi tek hücrelere sindirilebilir19.
Şekil 1: Mide hastası kaynaklı organoidlerin oluşumu. İyi huylu gastrik epitel biyopsilerinden gastrik hasta kaynaklı organoidlerin üretilmesi sürecini gösteren şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mide hastası kaynaklı organoidlerin pasajı. Gastrik hasta kaynaklı organoidlerin parçalanma yoluyla geçişini gösteren şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mide hastası kaynaklı organoid oluşumu ve büyümesi. (A) Tek hücreli tohumlama sonrası 10, 15 ve 20. günlerde mide organoidlerinin büyümesini gösteren temsili z-projeksiyon görüntüleri. Görüntüler, mide gövdesinden oluşturulan organoidler ve aynı hastadan alınan antrum biyopsi dokusuna aittir. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Tek hücreli tohumlama sonrası belirtilen zaman noktalarında ortalama (±SD) mide gövdesi ve antrum organoidi sayısı. (C) Tek hücreli tohumlama sonrası belirtilen zaman noktalarında mide gövdesi ve antrum organoidlerinin ortalama (±SD) alanı (μm2). n = grup ve zaman noktası başına 5 hasta. * = belirtilen zaman noktasında istatistiksel olarak anlamlı fark (p ≤ 0.05). NS = belirtilen zaman noktasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yok. İstatistiksel karşılaştırmalar 2 yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mide hastası kaynaklı organoid morfolojisi. (A) Tek hücreli tohumlamadan sonraki 15. günde mide gövdesi kaynaklı organoidlerin tek bir "kubbesinden" / kuyusundan farklı gastrik organoid morfolojilerinin temsili z-projeksiyon görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Ortalama (±SD) mide gövdesi ve antrum organoid küreselliği (burada 1 değeri = mükemmel bir küre). n = grup ve zaman noktası başına 5 hasta. NS = herhangi bir zaman noktasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yok. İstatistiksel karşılaştırmalar 2 yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mide hastası kaynaklı organoid pasajı. (A) Tek hücreli tohumlamadan sonraki 20. günde geçilmeye hazır organoidlerin temsili görüntüsü. (B) Tek hücreli tohumlamadan sonraki 25. günde geçiş için gecikmiş organoidlerin temsili görüntüsü. (C) Yeniden tohumlamadan sonra parçalanmış organoidlerin temsili görüntüsü (Pasaj 1 - Gün 0). (D) Yeniden tohumlamadan sonraki 5 gün boyunca organoid büyümesinin temsili görüntüsü (Geçiş 1 - Gün 5). Tüm görüntüler z-projeksiyonlarıdır. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Çözümler ve ortam tarifleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mide gövdesinden ve antrumdan iyi huylu epitel biyopsilerinden izole edilen tek hücrelerden insan mide organoidlerini güvenilir bir şekilde üretmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Protokoldeki kritik adımlar, bazal membran matrisinin ele alınmasının yanı sıra zamanlama etrafında döner. Canlılığı korumak için, biyopsi dokusunu aldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede protokolü başlatmak önemlidir. Amaç, biyopsi yapıldıktan sonraki 30 dakika içinde biyopsi dokusunun sindirilmeye başlanmasıdır. Bazal membran matrisinin taşınması da zor olabilir. Buz üzerinde çözüldüğünde sıvı kalır; ancak 4 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda polimerize olur. Bu nedenle, bazal membran matrisinin buzdan hızlı bir şekilde aktarılarak tek hücrelerle veya "kubbelerin" kaplanması için organoid parçalarla karıştırılması, bir dakika içinde polimerleşmeye başladığından derhal yapılmalıdır. Bir tüp içinde polimerize olduktan sonra, bir pipet ucuna aspire edilemez. Bu meydana gelirse, Matrigel tekrar sıvıya depolimerize olana kadar tüp buz üzerine yerleştirilebilir. Tek hücreleri veya organoid parçaları bazal membran matrisi ile karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparken, kabarcık oluşturmaktan kaçınmak da çok önemlidir. Bir bazal membran matrisi "kubbesindeki" kabarcıklar organoid oluşumunu ve büyümesini engellemiyor gibi görünse de, görselleştirmeyi engelleyebilirler. Ek olarak, bazal membran matrisi/hücre karışımını bir hücre kültürü plakasının kuyusuna/kuyularına ayırdıktan sonra, plaka ters çevrilmeli ve bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Bu adım, bazal membran matrisinin 3 boyutlu bir "kubbe" şeklinde polimerize olmasına izin vermek ve tek hücrelerin veya organoid parçaların plakanın dibine batmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
Bu protokol kullanılarak, mide organoidleri tek hücreli tohumlamadan sonraki 10 gün içinde tanımlanabilir. Deneyimler, 10. günden sonra çok az sayıda yeni mide organoidinin oluştuğunu ve aslında toplam organoid sayısının 10-20. günden biraz azalabileceğini göstermektedir. Bu, hem mide gövdesinden hem de antrumdan üretilen organoidler için geçerlidir. Bununla birlikte, gastrik antral biyopsilerden oluşan toplam organoid sayısı, gastrik vücut biyopsilerinden önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, antral organoidlerin büyümesi, tek hücreli tohumlamadan sonraki 10-20 gün arasında vücut organoidlerini büyük ölçüde aşar. Bu fark, Wnt duyarlılığındaki değişikliklere bağlanabilir. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, gastrik vücut PDO'larının daha düşük Wnt aktivasyonu ile daha iyi büyüme gösterdiğini, gastrik antrum PDO'larının ise daha yüksek Wnt aktivasyonu ile geliştiğini göstermiştir20. Gastrik PDO oluşturmak için kullanılan gastrik biyopsilerin yeri literatürde tipik olarak belirtilmemiştir. Bu tür farklılıklar, farklı mide bölgelerinin mide biyopsilerinden üretilen gastrik PDO'ları kullanan gelecekteki çalışmalarda dikkate alınmalıdır.
Bu protokolün bir diğer önemli yönü, gastrik PDO'ları güvenilir bir şekilde üretmek için "kubbe"/kuyu başına tohumlanacak standartlaştırılmış sayıda tek hücrenin oluşturulmasıdır. Daha önceki bir çalışma, PDO üretimi için tohumlanacak standart sayıda mide bezi bildirirken, tek bir hücre sindirim yöntemi kullanan önceki hiçbir çalışma, tohumlanan hücre sayısından veya sayının farklı PDO hatlarında tutarlı olup olmadığından bahsetmemiştir. Ekilen hücre sayısının standartlaştırılamaması, "kubbe" / kuyu başına oldukça değişken sayıda kök hücrenin tohumlanmasına neden olabilir. Kök hücreler mide organoid oluşumunun birincil kaynağı olduğundan, bu değişken organoid oluşumu ve büyüme oranlarına yol açabilir. Bu nedenle, standartlaştırılmamış sayıda tek hücrenin kullanılması, farklı gastrik PDO hatları arasında oluşum veya büyüme karşılaştırmalarının yorumlarını karıştırabilir. Burada, "kubbe" / kuyu başına 105 hücreye ekilen hücre sayısının standartlaştırılmasının, hem vücudun hem de midenin antral bölgelerinin biyopsilerinden gastrik PDO'ları güvenilir bir şekilde ürettiği gösterilmiştir.
Bu protokol taze gastrik biyopsi dokusu kullanımı için optimize edilmiştir. Sonuç olarak, bu protokolün başarısı, donmuş doku veya başka yollarla korunmuş doku kullanıldığında değişebilir. Ek olarak, biyopsi dokusu hastanın midesinden çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede işlendiğinden, taze biyopsilerin canlılığını ne kadar süre koruduğuna dair veri yoktur. Muhtemelen, taze doku işlemden önce ne kadar uzun süre oturursa, o kadar az canlı hücre izole edilecektir.
Gastrik PDO'ların bu protokolde anlatıldığı gibi fragmantasyon yoluyla geçirilmesi, rutin geçiş için kolay bir yöntem sağlar. Gastrik PDO'lar bu teknik kullanılarak 4 defaya kadar başarılı bir şekilde geçirilmiş olsa da, istikrarlı büyüme ve canlılığı korurken kaç kez geçilebileceklerini belirlemeye yönelik herhangi bir girişimde bulunulmamıştır. Bazı raporlar, mide organoidlerinin büyümesinin 5 veya daha fazla geçiştensonra yavaşlayabileceğini gösterirken, diğerleri 10 geçişe kadar güvenilir büyüme gözlemlemiştir23.
Bu protokolde kullanılan gastrik organoid besiyeri, L-WRN hücrelerinin şartlandırılmış besiyerinden türetilen Wnt-3A, noggin ve R-spondin içerir. Şartlandırılmış medyayı üretmek için Miyoshi ve Stappenbeck tarafından tanımlanan bir protokol kullanılır16. Alternatif olarak, Wnt-3A, noggin ve R-spondin, rekombinant proteinler olarak ayrı ayrı satın alınabilir. Tek tek bileşenlerin ayrı olarak satın alınması, L-WRN hücrelerinden şartlandırılmış ortam kullanılırken ortaya çıkabilecek olası parti etkilerinden kaçınmak için idealdir. Bununla birlikte, rekombinant proteinleri satın almak pahalıdır ve sıklıkla organoidlerle çalışan araştırmacılar için maliyet engelleyici olabilir.
Gastrik PDO'ların çeşitli uygulamalarda artan kullanımı göz önüne alındığında, benign gastrik PDO'ların üretilmesi için standart yaklaşımların oluşturulması zamanında ve gereklidir. Burada açıklanan protokol, gastrik PDO'ları kullanan gelecekteki araştırmalar için güvenilir bir yöntem sunar. Deneyimlerimize göre, bu protokol zamanın %90'ından fazlasında iyi huylu mide mukozasının biyopsilerinden başarılı bir şekilde organoidler üretmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.
Acknowledgments
Pennsylvania Üniversitesi Genomik Tıp T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Basser BRCA Merkezi'nde Erkekler ve BRCA Programı (KHB, BWK), DeGregorio Aile Vakfı Hibe Ödülü (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
