Etablering och karakterisering av patienthärledda magorganoider från biopsier av godartad magkropp och antralepitel

Summary

Magsäckspatientderiverade organoider används i allt högre grad inom forskningen, men formella protokoll för att generera mänskliga magorganoider från encelliga digests med standardiserad såddtäthet saknas. Detta protokoll presenterar en detaljerad metod för att på ett tillförlitligt sätt skapa magorganoider från biopsivävnad erhållen under övre endoskopi.

Abstract

Gastriska patientderiverade organoider (PDO) erbjuder ett unikt verktyg för att studera magbiologi och patologi. Följaktligen används dessa skyddade ursprungsbeteckningar i allt högre grad i ett brett spektrum av forskningstillämpningar. Det finns dock en brist på publicerade metoder för att producera magsäcks-PDO från encelliga nedbrytningar samtidigt som en standardiserad initial cellsåddstäthet bibehålls. I detta protokoll ligger tonvikten på initiering av magorganoider från isolerade enskilda celler och tillhandahållande av en metod för att passera organoider genom fragmentering. Viktigt är att protokollet visar att ett standardiserat tillvägagångssätt för den initiala cellsåddstätheten konsekvent ger magorganoider från godartad biopsivävnad och möjliggör standardiserad kvantifiering av organoidtillväxt. Slutligen stöder bevisen den nya observationen att magsäcks-PDO uppvisar varierande bildnings- och tillväxthastigheter baserat på om organoiderna kommer från biopsier av kroppen eller antrala regioner i magen. Specifikt avslöjas det att användningen av antral biopsivävnad för organoidinitiering resulterar i ett större antal bildade organoider och snabbare organoidtillväxt under en 20-dagarsperiod jämfört med organoider som genereras från biopsier av magkroppen. Protokollet som beskrivs här erbjuder utredare en snabb och reproducerbar metod för att framgångsrikt generera och arbeta med magsäcks-PDO.

Introduction

Organoider är miniatyr tredimensionella (3D) cellulära strukturer som liknar arkitekturen och funktionaliteten hos de organ från vilka^{de härstammar 1,2}. Dessa labbodlade modeller skapas genom att odla stamceller eller vävnadsspecifika celler i en kontrollerad miljö som gör det möjligt för dessa celler att självorganisera sig och differentiera till olika celltyper ^1,2,3. En av de viktigaste fördelarna med organoider är deras förmåga att rekapitulera mänsklig biologi närmare än traditionella tvådimensionella (2D) cellkulturer ^1,2,3. I synnerhet har mänskliga organoider visat sig bibehålla den genetiska mångfalden i sin ursprungsvävnad ^3,4,5. Organoider erbjuder en unik möjlighet att studera mänskliga organutveckling, modellera sjukdomar och testa potentiella terapier i en kontrollerad laboratoriemiljö. Dessutom kan organoider härledas från enskilda patientprover, vilket möjliggör personliga medicinska metoder och potentiell utveckling av individualiserade behandlingar ^3,6,7.

Forskare har använt mänskliga magorganoider för att undersöka olika aspekter av magbiologi och patologi. Framträdande exempel inkluderar användningen av patient-deriverade organoider (PDO) för att förutsäga kemoterapisvar vid magcancer ^8,9,10 och modellera epitelsvaret på Helicobacter pylori-infektion 11,12,13. Humana magorganoider består av olika celltyper som finns i magen, inklusive nackceller, gropceller och andra stödceller^11,14. Magorganoider kan antingen genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eller stamceller som isolerats direkt från magvävnad erhållen via biopsier eller från gastriska resektionsprover^11,14. Isolering av magstamceller från magvävnad görs vanligen genom att isolera och odla magkörtlar eller enzymatiskt smälta vävnadsprover för att frigöra enstaka celler ^9,13,15. Det är viktigt att notera att differentieringen av celler inom magorganoider som genereras med någon av dessa tekniker har visat sig vara likartad¹³. Protokollet som beskrivs här fokuserar på en encellsdigest.

Organoider representerar en vetenskaplig innovation som överbryggar klyftan mellan traditionell cellkultur och hela organ. I takt med att forskningen inom området fortsätter att utvecklas är organoider redo att bidra till utvecklingen av mer effektiva behandlingar och terapier för ett brett spektrum av tillämpningar. Med tanke på den ökande användningen av magsäcksskyddade sub finns det ett snabbt behov av ett standardiserat tillvägagångssätt för deras generering. Här beskrivs protokollet för att generera humana magsäcks-PDO:er från enskilda celler isolerade från godartad magbiopsivävnad förvärvad under övre endoskopi. Viktigt och unikt är att ett standardiserat antal enskilda celler bestäms för sådd för att på ett tillförlitligt sätt generera magsäcks-PDO:er och möjliggöra efterföljande karakterisering. Med hjälp av denna teknik påvisas tillförlitliga skillnader i bildning och tillväxt av organoider som genereras från biopsier av antingen magkroppen eller magsäcksantrum.

Protocol

All mänsklig vävnad som används i detta protokoll samlades in från individer som gav informerat samtycke till vävnadsinsamling genom en magvävnadsinsamlingsstudie godkänd av University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961). Deltagarna i denna studie var tvungna att genomgå en övre endoskopi som en del av sin rutinvård, vara minst 18 år gamla och kunna ge informerat samtycke. All forskning som genomfördes följde de riktlinjer som fastställts av University of Pennsylvania. <p class="jov…

Representative Results

De efterföljande representativa resultaten härrör från biopsier tagna från det godartade epitelet i både magkroppen och magsäckens antrumregioner i magen hos fem olika patienter som genomgår övre endoskopi. Två till fyra “kupoler”/brunnar pläterades och analyserades per patient för både magkropps- och antrumbiopsier. Organoider genererades framgångsrikt från magkroppen och ventrisk antrumbiopsivävnad från alla fem patienterna. I genomsnitt analyserades 41 organoider per “kupol”/brunn. Alla bilder är z-p…

Discussion

Häri beskrivs ett detaljerat protokoll för att på ett tillförlitligt sätt generera humana magorganoider från enskilda celler isolerade från biopsier av godartat epitel från magkroppen och antrum. Kritiska steg i protokollet kretsar kring timing samt hantering av basalmembranmatrisen. För att bevara livskraften är det viktigt att initiera protokollet så snart som möjligt efter att biopsivävnaden har förvärvats. Målet är att börja smälta biopsivävnaden inom 30 minuter efter att biopsin utförts. Att han…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503