Summary
胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。
Abstract
胃患者由来オルガノイド(PDO)は、胃の生物学と病理学を研究するためのユニークなツールを提供します。その結果、これらのPDOは、幅広い研究用途での使用が増加しています。しかし、標準化された初期細胞播種密度を維持しながら、単一細胞消化物から胃PDOを産生するための公表されたアプローチは不足しています。このプロトコルでは、重点は隔離された単一細胞からの胃のオルガノイドの開始および分裂によってオルガノイドを継代の方法の提供にある。重要なことに、このプロトコルは、最初の細胞播種密度への標準化されたアプローチが、良性の生検組織から胃オルガノイドを一貫して生成し、オルガノイド増殖の標準化された定量化を可能にすることを示しています。最後に、胃PDOは、オルガノイドが体の生検に由来するか、胃の胞状領域に由来するかに基づいて、さまざまな形成速度と増殖速度を示すという新しい観察結果を裏付ける証拠があります。具体的には、オルガノイド開始に門生検組織を使用すると、胃本体の生検から生成されたオルガノイドと比較して、より多くのオルガノイドが形成され、20日間にわたってオルガノイドの成長が速くなることが明らかになりました。本明細書に記載されているプロトコルは、研究者に胃PDOを正常に生成および操作するためのタイムリーで再現性のある方法を提供します。
Introduction
オルガノイドは、オルガノイドの元となった器官の構造や機能に似た、ミニチュアの3次元(3D)細胞構造です1,2。これらのラボで培養されたモデルは、幹細胞または組織特異的細胞を制御された環境で培養することによって作成され、これらの細胞が自己組織化してさまざまな細胞型に分化できるようにします1,2,3。オルガノイドの主な利点の1つは、従来の2次元(2D)細胞培養よりもヒトの生物学をより詳細に再現できることです1,2,3。特に、ヒトオルガノイドは、その起源組織の遺伝的多様性を維持することが示されている3,4,5。オルガノイドは、ヒトの臓器発生を研究し、疾患をモデル化し、制御された実験室環境で潜在的な治療法をテストするユニークな機会を提供します。さらに、オルガノイドは個々の患者サンプルから誘導できるため、個別化医療のアプローチと個別化治療の開発の可能性が可能になります3,6,7。
研究者は、ヒト胃オルガノイドを使用して、胃の生物学と病理学のさまざまな側面を調査してきました。顕著な例としては、患者由来オルガノイド(PDO)を使用して胃がんの化学療法反応を予測し8,9,10、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する上皮反応をモデル化することが挙げられます11,12,13。ヒト胃オルガノイドは、頸部細胞、ピット細胞、その他の支持細胞など、胃に見られるさまざまな種類の細胞で構成されています11,14。胃オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から作製するか、生検で得られた胃組織から直接単離された幹細胞、または胃切除標本から作製することができる11,14。胃組織からの胃幹細胞の単離は、通常、胃腺を単離して培養するか、組織サンプルを酵素的に消化して単一細胞を遊離することによって行われます9,13,15。重要なことに、これらの技術のいずれかを使用して生成された胃オルガノイド内の細胞の分化は、類似していることが示されています13。本明細書に記載のプロトコールは、単一細胞消化物に焦点を当てる。
オルガノイドは、従来の細胞培養と臓器全体のギャップを埋める科学的イノベーションです。この分野の研究が進むにつれ、オルガノイドは幅広い用途でより効果的な治療法や治療法の開発に貢献する態勢を整えています。胃PDOの利用が増加していることを考えると、その生成に対する標準化されたアプローチがタイムリーに必要とされています。ここでは、上部内視鏡検査中に獲得した良性の胃生検組織から単離された単一細胞からヒト胃PDOを生成するためのプロトコルが記載されている。重要かつユニークなのは、標準化された数の単一細胞が播種のために決定され、胃PDOを確実に生成し、その後の特性評価を可能にすることです。この技術を使用すると、胃本体または胃前庭部のいずれかの生検から生成されたオルガノイドの形成と成長の信頼できる違いが実証されます。
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Protocol
このプロトコルで利用されるすべてのヒト組織は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(IRB#842961)によって承認された胃組織収集研究を通じて、組織収集にインフォームドコンセントを提供した個人から収集されました。この研究の参加者は、日常的なケアの一環として上部内視鏡検査を受け、18歳以上であり、インフォームドコンセントを提供できる必要がありました。実施されたすべての研究は、ペンシルベニア大学が定めたガイドラインに準拠しています。
1. 実験準備
- 前述のように、コンディショニングされたL-WRNメディアを準備します16.必須ではありませんが、コンディショニング培地に含まれるWnt-3A、R-spondin、およびnogginの濃度は、メーカーの指示に従って市販のELISAキットを使用して確認できます( 材料表を参照)。
- RPMI-抗生物質(RPMI-ABX)、PBS-抗生物質(PBS-ABX)、PBS-ジチオスレイトール(PBS-DTT)、消化バッファー、および胃オルガノイド培地を調製します(詳細な組成については 補足表1 を参照)。胃オルガノイド培地は4°Cで1週間安定です。
- オートクレーブ鉗子、細かい解剖ハサミ、1.5 mLチューブ。
- 基底膜マトリックス(マトリゲル)を氷上で融解し始めます。
- 消化バッファーとトリプシン-EDTAを37°Cのウォーターバスで解凍します。
- インキュベーターオービタルシェーカーを37°C、200rpmに設定します。
2. 生検組織からの単一細胞の単離
- 上部内視鏡検査中に胃生検を収集します 施設の臨床プロトコルに従った17 、おそらくジャンボ鉗子の使用を含む。先端が鈍い針を使用して鉗子から組織サンプルを抽出し、RPMI-ABX培地を含む15 mLのコニカルチューブに入れます。チューブを氷上に置いて、実験室に迅速に移します。
注:少なくとも、2〜4回の生検を収集する必要があります。 - 生検組織を円錐形チューブの底に落ち着かせます。ピペットを使用して培地を吸引し、生検を1 mLのPBS-ABXバッファーで2回洗浄します。組織片は円錐形のチューブに自然に沈殿するため、遠心分離の必要はありません。
- 最低 20 mg の生検組織を、1 mL の PBS-DTT を含む 1.5 mL チューブに移します。
- 細かい解剖ハサミを使用して、組織を1〜2mm以下の断片に切断します。
- 卓上ミニ遠心分離機を15秒間使用して、チューブの底部に組織片を凝集させ、できるだけ多くの上清を吸引します。PBS-DTTの残存量は少量でも許容されます。
- 50 mLのコニカルチューブに、新たに加温した消化バッファー5 mLを加えます。組織を失わずに小さな組織片を移すには、消化バッファー 500 μL を採取し、組織を含む 1.5 mL チューブに加えます。次に、1000 μLのピペットチップの先端をハサミで修正してチップの直径を大きくし、消化バッファーを含む50 mLのコニカルチューブに組織片を簡単に吸引して移せるようにします。
- 消化バッファーと組織ミックスを37°Cで30分間インキュベートし、200rpmでオービタル振とうします。
- 0.25% EDTAを含む加温したトリプシン5 mLを消化バッファーに加え、200rpmでオービタル振とうしながら、37°Cでさらに10分間インキュベートします。
- 同量のAdvanced(Adv.)DMEM/F12培地を添加して消化バッファーとトリプシンを中和し、溶液を70 μmのセルストレーナーに通します。
- 1400 x g で4°Cで4分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 生検組織の初期サイズに応じて、小細胞ペレットが見えることもあれば見えないこともあります。
- 細胞ペレットを1 mLのAdv. DMEM/F12培地に再懸濁し、Trypan Blueと血球計算盤を用いて生細胞数をカウントします。
- 4°Cで4分間、1400 x g で遠心分離を行い、細胞を再度ペレット化し、上清を除去します。
注: 図1 は、生検組織から単一細胞を単離するプロセスの概略図を示しています。
3. 基底膜マトリックス「ドーム」への単一細胞の埋め込み
- カウントされた生細胞の数に基づいて、基底膜マトリックス50μLあたり105 個の生細胞の最終濃度を達成するために必要な基底膜マトリックスの量を計算します。
- めっき前に基底膜マトリックスが重合しないように、以下を速やかに行ってください。融解した基底膜マトリックスを氷から取り出し、以前に計算した基底膜マトリックスの容量を細胞に加え、ピペッティングで約10秒間上下させて静かに混合します。
注:このステップでは、気泡が発生しないようにすることが重要です。基底膜マトリックスを希釈しないでください。 - 基底膜マトリックス/細胞混合物の50 μLアリコートを、24ウェル組織培養プレート内の個々のウェルの中央に迅速にピペットで移します。
- すぐに24ウェルプレートを覆い、1回の滑らかな動きでプレートを逆さまにします。反転プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに35分間入れて、基底膜マトリックスを重合させます。
注:プレートを反転させることは、細胞がプレートの底に沈むのを防ぎ、基底膜マトリックスを3D「ドーム」形状に重合させるために不可欠です。 - 予め温めた胃オルガノイド培地500 μLを各ウェルに加え、各「ドーム」の上部が培地に完全に浸かるようにします。「ドーム」を乱さないように、各ウェルの側面にメディアを分配します。
- 2〜3日ごとにメディアを交換してください。
4. 断片化による オルガノイドの日常的な継代
- オルガノイドの継代準備が整ったら、指定された各ウェルから培地を取り出します。
注:継代の適切な時期を決定するには、代表的な結果のセクションを参照してください。 - 氷冷したAdv. DMEM/F12培地1 mLを、地下のメンブレンマトリックス「ドーム」に直接分注します。これにより、「ドーム」の解体が容易に開始されます。「ドーム」のすべての破片がプレートから剥がれるまで、吸引と分注を続けます。
- 培地と断片化された基底膜マトリックスの両方を次のウェルに輸送し、継代が予定されているすべてのウェルに対してこのプロセスを繰り返します。最終的な基底膜マトリックス「ドーム」を分解した後、培地とオルガノイドおよび基底膜マトリックスの混合物を 1.5 mL チューブに分注します。
- 1000 μL チップを P1000 ピペットに取り付け、このチップを 200 μL チップに挿入します。これにより、オルガノイドを断片化するのに十分な直径のピペットチップが作成され、さらに大きな容量の吸引が可能になります。
- オルガノイドと基底膜マトリックスの混合物を約25回上下に激しくピペットで移し、オルガノイドを細かく断片化します。
- 断片化したオルガノイド混合物を卓上遠心分離機で4°C、2000 x gで30秒間遠心分離します。これにより、断片化されたオルガノイドのペレットが基底膜マトリックスおよび培地から分離されます。ピペットを使用して、培地と基底膜マトリックス上清を吸引します。ペレットが緩んでいるため、上澄み液を吸引するために真空を使用しないでください。
- ウェル/ドームの数が1:2の比率(50 μL/ドーム)に分割されるように、融解したばかりの基底膜マトリックスの容量を計算します。新鮮な基底メンブレンマトリックスを加え、気泡を作らないように注意しながら、静かに上下にピペットで混ぜます。
- オルガノイド断片と基底膜マトリックスの混合物 50 μL を 24 ウェルプレートの個々のウェルに迅速に分注します。
- プレートを覆い、裏返して37°Cの組織培養インキュベーターに35分間入れ、基底膜マトリックスを重合させます。
- 予め温めた胃オルガノイド培地500 μLを各ウェルに加えます。
注: 図2 は、断片化による胃患者由来オルガノイドの継代の概要を示しています。
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Representative Results
その後の代表的な結果は、上部内視鏡検査を受けている5人の異なる患者の胃本体と胃の前部領域の両方の良性上皮から採取された生検から得られます。2〜4個の「ドーム」/ウェルを播種し、胃小体生検と前庭生検の両方について患者ごとに分析しました。オルガノイドは、5人の患者全員の胃体と胃前庭部生検組織から正常に生成されました。平均して、41のオルガノイドが「ドーム」/ウェルあたり分析されました。すべての画像は共焦点顕微鏡を使用して取得されたz投影であり、オルガノイドのサイズと球形度の定量化は、市販の画像解析ソフトウェアを使用して行われました( 材料表を参照)。
オルガノイドは一般に、単一細胞の播種後10日以内に同定可能です(図3A)。20日目までに、オルガノイドは大きくなり、通常は継代する必要があります。単一細胞播種後に形成されるオルガノイドの数は多少変動する可能性がありますが、体生検および幽閉胃生検から形成されるオルガノイドの数について予想される結果を 図3Bに示します。ボディオルガノイドとアントラルオルガノイドの数は、播種後10日目にピークに達します。有意ではありませんが、オルガノイドの総数は10日目から15日目、および15日目から20日目に減少し始めます。10日目までに形成され、その後成長を停止し、次の10日間で死滅する小さなオルガノイドの亜集団があるようであり、これがこの傾向を説明するでしょう。重要なことに、幽門生検組織から形成されたオルガノイドの数は、10、15、および20日目に体からの生検組織よりも有意に多いことが示されています。形成された胞状オルガノイドの数は、体から形成されたオルガノイドの数よりも平均して2倍多かった。
図3Cに、10日目から20日目までの単一細胞播種後のオルガノイド増殖の代表的な結果が示されています。前庭生検と体生検の両方のオルガノイドは10日目から20日目にかけて着実な成長を示しましたが、幽門生検組織から生成されたオルガノイドは、体生検組織から生成されたオルガノイドと比較して高い増殖速度を示しました。特に、前庭オルガノイドは、20日目に体オルガノイドよりも約4倍大きな面積を有していました。
異なる患者において、オルガノイド形態の多様性は、通常、単一の「ドーム」/ウェルで観察されます(図4A)。オルガノイドの中には、より丸いものや球形のものもあれば、より不規則な形態を示すものもあります。しかし、平均して、オルガノイドの球形の度合いを示すスフェリシティ(スコア1=完全な球体)18は、体または胞体生検組織から生成されたオルガノイド内およびオルガノイド間でほとんど変動を示さなかった(図4B)。したがって、増殖速度は異なりますが、通常、胃本体または前庭部の生検組織から生成されたオルガノイド間に有意な形態学的違いはありません。
開始後20日目までに、胃オルガノイドは通常、継代の準備が整います。オルガノイドのサイズが大きい(直径≥1500 μm)またはオルガノイドの内部が暗色している(細胞のターンオーバーが大きいことを示唆する)ことは、オルガノイドを継代する必要があることを示す重要な兆候です(図5A)。この時点を超えると、オルガノイドは継代後にオルガノイドを確実に再形成しない2D単層(図5B)に分解し始め、生存率や幹細胞性が失われている可能性があります。本明細書に記載の断片化プロトコルを用いて胃オルガノイドを継代および再播種した後、「ドーム」には多くのオルガノイド断片(図5C)が含まれ、それらはより多くのオルガノイドに再編成され、単一細胞の最初の播種(図5D)と比較してはるかに速く増殖します。継代時にオルガノイドの増殖にまだ特性評価および/または標準化が必要な場合は、前述のように、胃オルガノイドを代わりに単一細胞に消化することができます19。
図1:胃患者由来オルガノイドの生成。 良性胃上皮の生検から胃患者由来オルガノイドを生成するプロセスを示す概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:胃患者由来オルガノイドの継代。 断片化による胃患者由来オルガノイドの継代を示す概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:胃患者由来のオルガノイドの形成と成長。 (A)単一細胞播種後10日目、15日目、20日目の胃オルガノイドの増殖を示す代表的なz投影画像。画像は、同じ患者の胃体と前庭部生検組織から生成されたオルガノイドです。スケールバー = 1 mm。 (B) 単一細胞播種後の示された時点での胃小体オルガノイドおよび前庭オルガノイドの平均 (±SD) 数。(C)単一細胞播種後の示された時点での胃小体オルガノイドおよび前庭オルガノイドの平均(±SD)面積(μm2)。n = グループおよび時点あたり 5 人の患者。* = 指定された時点での統計的に有意な差 (p ≤ 0.05)。N.S. = 示された時点で統計的に有意な差はありません。2 因子分散分析 による 統計的比較。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:胃患者由来オルガノイド形態 。 (A)単一細胞播種後15日目の胃体由来オルガノイドの個々の「ドーム」/ウェルからのさまざまな胃オルガノイド形態の代表的なz投影画像。スケールバー = 200 μm。 (B) 平均 (±SD) 胃小体および前庭オルガノイドの球状度 (ここで、値 1 = 完全な球)。n = グループおよび時点あたり 5 人の患者。N.S. = どの時点でも統計的に有意な差はありません。2 因子分散分析による統計的比較。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:胃患者由来オルガノイド継代。 (A)単一細胞播種後20日目に継代する準備ができているオルガノイドの代表的な画像。(B)単一細胞播種後25日目の継代期限を過ぎたオルガノイドの代表画像。(C)再播種後の断片化されたオルガノイドの代表画像(継代1-0日目)。(D)再播種後5日間のオルガノイド増殖の代表画像(継代1-5日目)。すべての画像は Z 投影法です。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足表1:溶液と培地のレシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書では、胃本体および前庭部からの良性上皮の生検から単離された単一細胞からヒト胃オルガノイドを確実に生成するための詳細なプロトコルが概説される。プロトコルの重要なステップは、タイミングと基底膜マトリックスの取り扱いを中心に展開します。生存率を維持するためには、生検組織を取得した後、できるだけ早くプロトコルを開始することが不可欠です。目的は、生検が実施されてから30分以内に生検組織の消化を開始することです。また、基底膜マトリックスの取り扱いも困難な場合があります。氷の上で解凍すると、液体のままです。ただし、4°Cを超える温度では重合します。したがって、基底膜マトリックスを氷から迅速に移し替えて、単一細胞またはオルガノイド断片と混合して「ドーム」をプレーティングすることは、1分以内に重合を開始するため、迅速に行う必要があります。チューブ内で重合すると、ピペットチップに吸引することはできません。これが発生した場合は、マトリゲルが解重合して液体に戻るまで、チューブを氷上に置くことができます。ピペッティングを静かに上下させて単一細胞またはオルガノイド断片を基底膜マトリックスと混合する場合、気泡を発生させないことも重要です。基底膜マトリックス「ドーム」内の気泡は、オルガノイドの形成と成長を妨げないように思われますが、可視化を妨げる可能性があります。さらに、基底膜マトリックス/細胞混合物を細胞培養プレートのウェルに分注した後、プレートを反転させてインキュベーターに入れる必要があります。このステップは、基底膜マトリックスを3Dの「ドーム」形状に重合させ、単一細胞またはオルガノイド断片がプレートの底に沈むのを防ぐために重要です。
このプロトコルを使用すると、胃オルガノイドは単一細胞播種から10日以内に同定できます。経験上、10日目以降に新しい胃オルガノイドが形成されることはほとんどなく、実際、オルガノイドの総数は10日目から20日目にかけてわずかに減少する可能性があります。これは、胃本体と前庭部の両方から生成されるオルガノイドに当てはまります。しかし、胃前庭生検から形成されたオルガノイドの総数は、胃体生検から形成されるオルガノイドよりも有意に多い。さらに、胞状オルガノイドの増殖は、単一細胞播種後10〜20日目の間に体オルガノイドを大幅に上回ります。この違いは、Wnt感度のばらつきに起因している可能性があります。最近の研究では、胃本体PDOはWnt活性化が低いほど成長が良好であるのに対し、胃前庭部PDOはWnt活性化が高いほど増殖することが実証されています20。胃PDOの生成に使用される胃生検の位置は、通常、文献では特定されていません。このような違いは、異なる胃領域の胃生検から生成された胃PDOを利用する将来の研究で考慮する必要があります。
このプロトコルのもう一つの重要な側面は、確実に胃PDOを生成するための「ドーム」/ウェルごとに播種する標準化された数の単一細胞の確立です。以前の研究では、PDO生成のために播種する胃腺の標準化された数が報告されていますが、単一細胞消化法を使用した以前の研究では、播種された細胞の数や、その数が異なるPDO株間で一貫しているかどうかについて言及されていません。播種する細胞の数を標準化しないと、「ドーム」/ウェルごとに播種される幹細胞の数が非常に変動する可能性があります。幹細胞は胃オルガノイド形成の主要な供給源であるため、オルガノイドの形成と増殖の速度にばらつきが生じる可能性があります。したがって、標準化されていない数の単一細胞を利用すると、異なる胃PDO株間の形成または増殖の比較の解釈が混乱する可能性があります。ここでは、10個に播種した細胞数を「ドーム」/ウェルあたり5個に 標準化することで、胃の身体と前庭の両方の生検から胃PDOを確実に生成できることが実証されています。
このプロトコルは、新鮮な胃生検組織の使用に最適化されました。その結果、このプロトコルの成功は、凍結組織または他の手段によって保存された組織を使用する場合に変化し得る。さらに、生検組織は患者の胃から摘出された後できるだけ早く処理されるため、新鮮な生検が生存率を維持する期間に関するデータはありません。おそらく、新鮮な組織が処理前に長く放置されるほど、分離される生細胞は少なくなります。
このプロトコルに記載されているように、フラグメンテーションによる胃PDOの継代は、日常的な継代のための簡単な方法を提供します。胃PDOは、この技術を用いて最大4回まで継代に成功しているが、着実な成長と生存率を維持しながら、何回継代できるかを決定する試みはなかった。いくつかの報告は、胃オルガノイドの成長が5回以上の継代後に遅くなる可能性があることを示しています21,22が、他の報告では、最大10回の継代で信頼できる成長が観察されています23。
このプロトコルで使用される胃オルガノイド媒体はL-WRNのセルの調節された媒体から得られるWnt-3A、nogginおよびR-spondinを含んでいる。馴染め培地を製造するために、三好とスタッペンベックによって記述されたプロトコルが利用される16。あるいは、Wnt-3A、ノギン、およびR-スポンディンは、組換えタンパク質として別途購入することができます。個々のコンポーネントを個別に購入することは、L-WRN細胞から馴化培地を使用する際に発生する可能性のある潜在的なバッチ効果を回避するために理想的です。しかし、組換えタンパク質の購入は高価であり、オルガノイドを頻繁に扱う研究者にとっては法外な費用がかかる可能性があります。
さまざまな用途で胃PDOの使用が増加していることを考えると、良性の胃PDOを生成するための標準化されたアプローチを確立することはタイムリーかつ必要です。ここで説明するプロトコルは、胃PDOを利用した将来の調査のための信頼できる方法を提供します。私たちの経験では、このプロトコルは、90%以上の確率で良性胃粘膜の生検からオルガノイドを生成することに成功しています。
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Disclosures
著者らは関連する開示をしていない。
Acknowledgments
ペンシルベニア大学ゲノム医学T32 HG009495(KHB)、NCI R21 CA267949(BWK)、Basser Center for BRCAの男性とBRCAプログラム(KHB、BWK)、デグレゴリオファミリー財団助成賞(BWK)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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