Establecimiento y caracterización de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biopsias de cuerpo gástrico benigno y epitelio antral
Summary
Los organoides gástricos derivados de pacientes encuentran un uso cada vez mayor en la investigación, sin embargo, faltan protocolos formales para generar organoides gástricos humanos a partir de digestión de una sola célula con densidad de siembra estandarizada. Este protocolo presenta un método detallado para crear organoides gástricos de forma fiable a partir de tejido de biopsia obtenido durante la endoscopia superior.
Abstract
Los organoides gástricos derivados del paciente (PDO) ofrecen una herramienta única para estudiar la biología y la patología gástrica. En consecuencia, estas DOP se utilizan cada vez más en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Sin embargo, existe una escasez de enfoques publicados para producir PDO gástricas a partir de digestión de una sola célula, manteniendo al mismo tiempo una densidad de siembra celular inicial estandarizada. En este protocolo, se hace hincapié en la iniciación de organoides gástricos a partir de células individuales aisladas y en la provisión de un método para el paso de organoides a través de la fragmentación. Es importante destacar que el protocolo demuestra que un enfoque estandarizado para la densidad inicial de siembra celular produce organoides gástricos a partir de tejido de biopsia benigna y permite la cuantificación estandarizada del crecimiento de organoides. Por último, la evidencia apoya la nueva observación de que las PDO gástricas muestran tasas variables de formación y crecimiento en función de si los organoides se originan en biopsias del cuerpo o en regiones antrales del estómago. Específicamente, se revela que el uso de tejido de biopsia antral para la iniciación de organoides da como resultado un mayor número de organoides formados y un crecimiento más rápido de organoides durante un período de 20 días en comparación con los organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico. El protocolo descrito en este documento ofrece a los investigadores un método oportuno y reproducible para generar y trabajar con éxito con PDO gástricas.
Introduction
Los organoides son estructuras celulares tridimensionales (3D) en miniatura que se asemejan a la arquitectura y funcionalidad de los órganos de los que se derivaron 1,2. Estos modelos cultivados en laboratorio se crean mediante el cultivo de células madre o células específicas de tejido en un entorno controlado que permite que estas células se autoorganicen y se diferencien en varios tipos de células 1,2,3. Una de las principales ventajas de los organoides es su capacidad para recapitular la biología humana más de cerca que los cultivos celulares bidimensionales (2D) tradicionales 1,2,3. En particular, se ha demostrado que los organoides humanos mantienen la diversidad genética de su tejido de origen 3,4,5. Los organoides ofrecen una oportunidad única para estudiar el desarrollo de los órganos humanos, modelar enfermedades y probar posibles terapias en un entorno de laboratorio controlado. Además, los organoides pueden derivarse de muestras individuales de pacientes, lo que permite enfoques de medicina personalizada y el desarrollo potencial de tratamientos individualizados 3,6,7.
Los investigadores han utilizado organoides gástricos humanos para investigar varios aspectos de la biología y la patología gástrica. Ejemplos destacados incluyen el uso de organoides derivados del paciente (PDO) para predecir las respuestas a la quimioterapia del cáncer gástrico 8,9,10 y modelar la respuesta epitelial a la infección por Helicobacter pylori 11,12,13. Los organoides gástricos humanos consisten en varios tipos de células que se encuentran en el estómago, incluidas las células del cuello, las células de la fosa y otras células de soporte11,14. Los organoides gástricos pueden generarse a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre aisladas directamente del tejido gástrico obtenido mediante biopsias o de muestras de resección gástrica11,14. El aislamiento de las células madre gástricas del tejido gástrico se realiza comúnmente mediante el aislamiento y cultivo de glándulas gástricas o la digestión enzimática de muestras de tejido para liberar células individuales 9,13,15. Es importante destacar que la diferenciación de las células dentro de los organoides gástricos generados mediante cualquiera de estas técnicas ha demostrado ser similar13. El protocolo descrito en este documento se centra en un resumen de una sola célula.
Los organoides representan una innovación científica que cierra la brecha entre el cultivo celular tradicional y los órganos completos. A medida que la investigación en el campo continúa progresando, los organoides están preparados para contribuir al desarrollo de tratamientos y terapias más efectivos para una amplia gama de aplicaciones. Dada la creciente utilización de las DOP gástricas, existe una necesidad oportuna de un enfoque estandarizado para su generación. En este trabajo se describe el protocolo para la generación de PDOs gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de tejido de biopsia gástrica benigna adquirido durante la endoscopia alta. De manera importante y única, se determina un número estandarizado de células individuales para la siembra con el fin de generar de manera confiable PDO gástricas y permitir la caracterización posterior. Utilizando esta técnica, se demuestran diferencias confiables en la formación y crecimiento de organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico o del antro gástrico.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se describe un protocolo detallado para generar de forma fiable organoides gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de biopsias de epitelio benigno del cuerpo gástrico y el antro. Los pasos críticos en el protocolo giran en torno al tiempo, así como al manejo de la matriz de la membrana basal. Para preservar la viabilidad, es fundamental iniciar el protocolo lo antes posible después de adquirir el tejido de la biopsia. El objetivo es comenzar a digerir el tejido de la biopsia dent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Medicina Genómica de la Universidad de Pensilvania T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Programa de Hombres y BRCA en el Centro Basser para BRCA (KHB, BWK), Premio de Subvención de la Fundación de la Familia DeGregorio (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
