Органоиды, полученные от желудочных пациентов, находят все большее применение в исследованиях, однако формальные протоколы получения органоидов желудка человека из одноклеточных пищеварителей со стандартизированной плотностью посева отсутствуют. В данном протоколе представлен подробный метод надежного создания органоидов желудка из биопсийной ткани, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка.
Органоиды, полученные от пациентов желудка (PDOs), предлагают уникальный инструмент для изучения биологии и патологии желудка. Следовательно, эти PDO находят все большее применение в широком спектре исследовательских приложений. Тем не менее, существует нехватка опубликованных подходов к получению желудочных ЗОП из одноклеточных дигестов при сохранении стандартизированной начальной плотности посева клеток. В этом протоколе акцент делается на инициации желудочных органоидов из изолированных единичных клеток и предоставлении метода пассации органоидов путем фрагментации. Важно отметить, что протокол демонстрирует, что стандартизированный подход к начальной плотности посева клеток последовательно дает органоиды желудка из доброкачественной биопсийной ткани и позволяет стандартизировать количественную оценку роста органоидов. Наконец, фактические данные подтверждают новое наблюдение о том, что желудочные ЗОП демонстрируют различную скорость образования и роста в зависимости от того, происходят ли органоиды из биопсии тела или антральных областей желудка. В частности, выявлено, что использование ткани антральной биопсии для инициации органоидов приводит к образованию большего количества органоидов и более быстрому росту органоидов в течение 20-дневного периода по сравнению с органоидами, полученными из биопсии тела желудка. Протокол, описанный в настоящем документе, предлагает исследователям своевременный и воспроизводимый метод успешного создания и работы с желудочными ЗОП.
Органоиды представляют собой миниатюрные трехмерные (3D) клеточные структуры, которые напоминают архитектуру и функциональность органов, из которых они были получены 1,2. Эти выращенные в лаборатории модели создаются путем культивирования стволовых клеток или тканеспецифичных клеток в контролируемой среде, которая позволяет этим клеткам самоорганизовываться и дифференцироваться в различные типы клеток 1,2,3. Одним из ключевых преимуществ органоидов является их способность более точно повторять биологию человека, чем традиционные двумерные (2D) клеточные культуры 1,2,3. В частности, было показано, что органоиды человека сохраняют генетическое разнообразие тканей своего происхождения 3,4,5. Органоиды дают уникальную возможность изучать развитие органов человека, моделировать заболевания и тестировать потенциальные терапевтические средства в контролируемых лабораторных условиях. Кроме того, органоиды могут быть получены из индивидуальных образцов пациентов, что позволяет применять персонализированные подходы к медицине и потенциальную разработку индивидуализированных методов лечения 3,6,7.
Исследователи использовали органоиды желудка человека для изучения различных аспектов биологии и патологии желудка. Яркими примерами являются использование органоидов, полученных от пациентов (PDO), для прогнозирования ответов на химиотерапию рака желудка 8,9,10 и моделирования эпителиального ответа на инфекцию Helicobacter pylori 11,12,13. Органоиды желудка человека состоят из различных типов клеток, обнаруженных в желудке, включая клетки шеи, клетки ямки и другие поддерживающие клетки11,14. Органоиды желудка могут быть получены либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо из стволовых клеток, непосредственно выделенных из ткани желудка, полученной с помощью биопсии, или из образцов резекции желудка11,14. Выделение желудочных стволовых клеток из желудочной ткани обычно осуществляется путем изоляции и культивирования желудочных желез или ферментативного расщепления образцов тканей для высвобождения отдельных клеток 9,13,15. Важно отметить, что дифференцировка клеток в органоидах желудка, полученных с помощью любого из этих методов, была аналогичной13. Протокол, описанный здесь, основан на дайджесте с одной клеткой.
Органоиды представляют собой научную инновацию, которая устраняет разрыв между традиционной клеточной культурой и целыми органами. По мере того, как исследования в этой области продолжают прогрессировать, органоиды готовы внести свой вклад в разработку более эффективных методов лечения и терапии для широкого спектра применений. Учитывая растущее использование желудочных ЗОП, существует острая необходимость в стандартизированном подходе к их созданию. Описан протокол получения ЗОП желудка человека из единичных клеток, выделенных из доброкачественной биопсийной ткани желудка, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка. Важно и уникально то, что для посева определяется стандартизированное количество отдельных клеток, чтобы надежно генерировать желудочные ЗОП и позволять впоследствии характеризовать. С помощью этого метода продемонстрированы достоверные различия в образовании и росте органоидов, полученных при биопсии тела желудка или антрального слоя желудка.
Изложен подробный протокол достоверной генерации органоидов желудка человека из единичных клеток, выделенных из биоптатов доброкачественного эпителия из тела желудка и антрума. Важнейшие этапы протокола связаны с синхронизацией, а также с обработкой матрицы базальной мембраны. Для ?…
The authors have nothing to disclose.
Университет Пенсильвании по геномной медицине T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), программа Men & BRCA в Центре Бассера для BRCA (KHB, BWK), грант Фонда семьи ДеГрегорио (BWK).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
BZ-X710 | Keyence | n/a | |
cellSens | Olympus | n/a | |
Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
DPBS | Gibco | 14200-075 | |
Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel | Corning | 47743-715 | |
Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |