Benign Gastrik Vücut ve Antral Epitel Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Gastrik Organoidlerin Oluşturulması ve Karakterizasyonu
Summary
Mide hastası kaynaklı organoidler araştırmalarda giderek artan bir kullanım alanı bulmaktadır, ancak standartlaştırılmış tohumlama yoğunluğuna sahip tek hücreli sindirimlerden insan mide organoidleri üretmek için resmi protokoller eksiktir. Bu protokol, üst endoskopi sırasında elde edilen biyopsi dokusundan gastrik organoidlerin güvenilir bir şekilde oluşturulması için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Abstract
Mide hastası kaynaklı organoidler (PDO’lar), mide biyolojisi ve patolojisini incelemek için benzersiz bir araç sunar. Sonuç olarak, bu PDO’lar çok çeşitli araştırma uygulamalarında artan bir kullanım alanı bulmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış bir başlangıç hücre tohumlama yoğunluğunu korurken, tek hücreli sindirimlerden gastrik PDO’lar üretmek için yayınlanmış yaklaşımların eksikliği vardır. Bu protokolde, izole edilmiş tek hücrelerden mide organoidlerinin başlatılması ve organoidlerin parçalanma yoluyla geçirilmesi için bir yöntemin sağlanması üzerinde durulmaktadır. Daha da önemlisi, protokol, ilk hücre tohumlama yoğunluğuna standartlaştırılmış bir yaklaşımın, iyi huylu biyopsi dokusundan tutarlı bir şekilde gastrik organoidler verdiğini ve organoid büyümesinin standartlaştırılmış nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir. Son olarak, kanıtlar, gastrik PDO’ların, organoidlerin vücudun biyopsilerinden mi yoksa midenin antral bölgelerinden mi kaynaklandığına bağlı olarak değişen oluşum ve büyüme oranları gösterdiğine dair yeni gözlemi desteklemektedir. Spesifik olarak, organoid başlatma için antral biyopsi dokusunun kullanılmasının, mide gövdesinin biyopsilerinden üretilen organoidlere kıyasla 20 günlük bir süre boyunca daha fazla sayıda organoid oluşumu ve daha hızlı organoid büyümesi ile sonuçlandığı ortaya konmuştur. Burada açıklanan protokol, araştırmacılara gastrik PDO’ları başarılı bir şekilde oluşturmak ve bunlarla çalışmak için zamanında ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.
Introduction
Organoidler, türetildikleri organların mimarisine ve işlevselliğine benzeyen minyatür üç boyutlu (3D) hücresel yapılardır 1,2. Laboratuvarda yetiştirilen bu modeller, kök hücrelerin veya dokuya özgü hücrelerin, bu hücrelerin kendi kendini organize etmesine ve çeşitli hücre tiplerine farklılaşmasına izin veren kontrollü bir ortamda yetiştirilmesiyle oluşturulur 1,2,3. Organoidlerin en önemli avantajlarından biri, insan biyolojisini geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürlerindendaha yakından özetleme yetenekleridir 1,2,3. Özellikle, insan organoidlerinin orijin dokularının genetik çeşitliliğini koruduğu gösterilmiştir 3,4,5. Organoidler, kontrollü bir laboratuvar ortamında insan organı gelişimini incelemek, hastalıkları modellemek ve potansiyel terapötikleri test etmek için eşsiz bir fırsat sunar. Ayrıca, organoidler bireysel hasta örneklerinden elde edilebilir, bu da kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarına ve bireyselleştirilmiş tedavilerin potansiyel olarak geliştirilmesine olanak tanır 3,6,7.
Araştırmacılar, mide biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini araştırmak için insan mide organoidlerini kullandılar. Öne çıkan örnekler arasında mide kanseri kemoterapi yanıtlarınıtahmin etmek için hasta kaynaklı organoidlerin (PDO’lar) kullanımı 8,9,10 ve Helicobacter pylori enfeksiyonunaepitelyal yanıtı modellemek 11,12,13 yer alır. İnsan mide organoidleri, boyun hücreleri, çukur hücreleri ve diğer destekleyici hücreler dahil olmak üzere midede bulunan çeşitli hücre tiplerinden oluşur11,14. Gastrik organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) veya biyopsiler yoluyla elde edilen mide dokusundan veya gastrik rezeksiyon örneklerinden doğrudan izole edilen kök hücrelerdenüretilebilir 11,14. Mide kök hücrelerinin mide dokusundan izolasyonu yaygın olarak mide bezlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi veya tek hücreleri serbest bırakmak için doku örneklerinin enzimatik olarak sindirilmesiyle yapılır 9,13,15. Önemli olarak, bu tekniklerden herhangi biri kullanılarak üretilen mide organoidleri içindeki hücrelerin farklılaşmasının benzer olduğu gösterilmiştir13. Burada açıklanan protokol, tek hücreli bir özete odaklanır.
Organoidler, geleneksel hücre kültürü ile tüm organlar arasındaki boşluğu dolduran bilimsel bir yeniliği temsil eder. Alandaki araştırmalar ilerlemeye devam ettikçe, organoidler çok çeşitli uygulamalar için daha etkili tedavilerin ve terapilerin geliştirilmesine katkıda bulunmaya hazırdır. Gastrik PDO’ların artan kullanımı göz önüne alındığında, bunların üretilmesi için standart bir yaklaşıma zamanında ihtiyaç vardır. Burada, üst endoskopi sırasında elde edilen iyi huylu gastrik biyopsi dokusundan izole edilen tek hücrelerden insan gastrik PDO’larının üretilmesi için protokol açıklanmaktadır. Önemli ve benzersiz bir şekilde, gastrik PDO’ları güvenilir bir şekilde oluşturmak ve sonraki karakterizasyona izin vermek için tohumlama için standartlaştırılmış sayıda tek hücre belirlenir. Bu teknik kullanılarak, mide gövdesi veya mide antrumunun biyopsilerinden üretilen organoidlerin oluşumu ve büyümesinde güvenilir farklılıklar gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mide gövdesinden ve antrumdan iyi huylu epitel biyopsilerinden izole edilen tek hücrelerden insan mide organoidlerini güvenilir bir şekilde üretmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Protokoldeki kritik adımlar, bazal membran matrisinin ele alınmasının yanı sıra zamanlama etrafında döner. Canlılığı korumak için, biyopsi dokusunu aldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede protokolü başlatmak önemlidir. Amaç, biyopsi yapıldıktan sonraki 30 dakika içinde biyopsi dokusunun s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pennsylvania Üniversitesi Genomik Tıp T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Basser BRCA Merkezi’nde Erkekler ve BRCA Programı (KHB, BWK), DeGregorio Aile Vakfı Hibe Ödülü (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
