Summary
La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.
Abstract
El microambiente tumoral implica interacciones entre las células huésped, las células tumorales, las células inmunitarias, las células estromales y la vasculatura. La caracterización y organización espacial de los subconjuntos de células inmunitarias y las proteínas diana son cruciales para fines pronósticos y terapéuticos. Esto ha llevado al desarrollo de métodos de tinción inmunohistoquímica multiplexada. La inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple permite la detección simultánea de múltiples marcadores, lo que facilita una comprensión integral de la función celular y las interacciones intercelulares. En este artículo, describimos un flujo de trabajo para el ensayo de inmunohistoquímica fluorescente cíclico múltiple y su aplicación en el análisis de cuantificación de subconjuntos de linfocitos. La tinción inmunohistoquímica fluorescente cíclica múltiple sigue pasos y reactivos similares a los de la inmunohistoquímica estándar, que incluye la recuperación de antígenos, la incubación cíclica de anticuerpos y la tinción en un portaobjetos de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Durante la reacción antígeno-anticuerpo, se prepara una mezcla de anticuerpos de diferentes especies. Las condiciones, como el tiempo de recuperación de antígenos y la concentración de anticuerpos, se optimizan y validan para aumentar la relación señal-ruido. Esta técnica es reproducible y sirve como una herramienta valiosa para la investigación de inmunoterapia y aplicaciones clínicas.
Introduction
Las metástasis cerebrales (MO) representan los tumores más comunes del sistema nervioso central (SNC), que se presentan en casi la mitad de los casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), con un pronóstico precario1. Se estima que entre el 10% y el 20% de los pacientes con CPNM ya tienen MO en el momento del diagnóstico inicial, y aproximadamente el 40% de los casos de CPNM desarrollarán MO durante el cursodel tratamiento. El microambiente tumoral (TME) está estrechamente asociado con la aparición de CPCNP y la MO, incluyendo varios componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células inmunitarias linfoides, derivadas de la médula ósea y moléculas de señalización 3,4. Las células inmunitarias microambientales desempeñan un papel crucial en la influencia del crecimiento y desarrollo de las células cancerosas. Las metástasis cerebrales presentan numerosas dianas terapéuticas potenciales caracterizadas por microambientes inmunológicos complejos y procesos de señalización. Por ejemplo, los inhibidores de PD-1 han demostrado eficacia clínica para pacientes con metástasis cerebral de cáncer de pulmón (LCBM) como inhibidor de puntos de control inmunitario (ICI). Sin embargo, la frecuencia de las respuestas a la terapia con PD-1 varía entre el CPCNP primario y el LCBM5, lo que sugiere que el microambiente inmunitario tumoral actúa como un regulador crítico de la ICI.
La inmunohistoquímica (IHQ) es una herramienta invaluable en los campos de la biología, la medicina básica y la patología6. Este método de detección visualiza la expresión de antígeno a través de la interacción antígeno-anticuerpo en un portaobjetos de tejido7. La IHQ se utiliza para diagnosticar marcadores predictivos, evaluar marcadores pronósticos, guiar terapias dirigidas y explorar las funciones biológicas de las células tumorales8. Sin embargo, el método tradicional de IHQ solo puede detectar un biomarcador a la vez. Para hacer frente a esta limitación, la innovación de la tecnología inmunohistoquímica ha llevado al desarrollo de la inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple (mfIHC), que permite la identificación simultánea de múltiples marcadores proteicos en el mismo portaobjetos tisular, tanto en campo claro como en campo fluorescente9. Este avance proporciona un análisis preciso de la composición celular y las interacciones moleculares entre las células estromales, las células inmunitarias y las células cancerosas dentro de la TME.
En este estudio, presentamos un protocolo de inmunohistoquímica cíclica múltiple para analizar la distribución espacial de las células inmunes. Se eligen dos anticuerpos primarios de diferentes especies, como conejo y rata, para la incubación simultáneamente, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La recuperación de antígenos se realiza después de cada ronda de reacción antígeno-anticuerpo. Se bloquea la autofluorescencia y se utiliza 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. El panel incluye la detección secuencial de células CD3, CD8, CD20 y CK, las células se clasifican según los marcadores: células tumorales (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)10,11.
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Protocol
La investigación fue aprobada por el comité de ética médica del Hospital Oncológico de Yunnan / Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming. Todos los sujetos/tutores legales firmaron el consentimiento informado.
1. Preparación de portaobjetos
- Cortar secciones de bloques de parafina pareados que contengan células de metástasis cerebrales de tumor de pulmón primario o cáncer de pulmón con un grosor de 4 μm utilizando un micrótomo. Retira las secciones al agua y sepáralas con unas pinzas, elige la mejor y adhiérela al portaobjetos recubierto de polilisina.
- Coloque los portaobjetos de pañuelos en un horno a 65 °C durante 30 minutos para mejorar la adherencia de los tejidos.
- Sumerja los portaobjetos en xileno a través de tres cambios, cada uno de los cuales dura 10 minutos.
- Reduzca gradualmente la concentración de alcohol e incube los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 minutos, etanol al 90% durante 5 minutos, etanol al 75% durante 5 minutos y en agua desionizada durante 3 minutos.
2. Recuperación de epítopos inducida por calor (HIER)
- Diluya 100x solución tampón de citrato de sodio (pH 6.0) a 1x (10 mM) en agua desionizada, preparando suficiente solución tampón para sumergir completamente los portaobjetos.
- Coloque los portaobjetos en una olla a presión, sometiéndolos a calor alto (100 ° C) y presión (~ 30 psi) durante 2 min. Después de calentar, deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente en agua destilada durante 3 minutos.
- Disolver un paquete de 52 g de solución salina tamponada con fosfato (PBS; en polvo) en 5 L de agua desionizada para preparar la solución tampón PBS (pH 7,0). Coloque los portaobjetos en una solución tampón PBS durante 5 minutos, con 3 cambios.
3. Bloqueo de la peroxidasa
- Cubrir las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos en PBS, 3 veces durante 5 minutos cada uno.
- Use papel de filtro para absorber el exceso de agua lejos del perímetro del tejido. Mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.
4. Incubación primaria de anticuerpos para la primera ronda
- Preparar una mezcla de trabajo de los anticuerpos primarios para CD8 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon SP16) y CD20 (anticuerpo monoclonal de ratón, clon L26), diluida 1:50 en diluyente de anticuerpos primarios Bond.
- Añadir el complejo de anticuerpos a las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Preparar una solución de solución salina tamponada con 0,1% de Tween/fosfato: 1 mL de Tween en 1 L de solución tampón de PBS.
- Lave las secciones con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una. Use papel de filtro para alejar el exceso de agua del perímetro del pañuelo, mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.
5. Incubación secundaria de anticuerpos para la primera ronda
- Preparar una mezcla de anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con fluorescencia (Excitación (Ex): 495 nm) y anticuerpo anti-ratón de cabra (Ex: 578 nm), diluido 1:50 en solución salina tampón fosfato. El anticuerpo anti-conejo de cabra se une al anticuerpo primario de CD8, y el anticuerpo anti-ratón de cabra se une al anticuerpo primario de CD20.
- Añadir la mezcla de anticuerpos secundarios gota a gota e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Recuperación de epítopos inducida por calor y bloqueo de peroxidasa
- Diluir citrato de sodio 100x (pH 6.0) a 1x (10 mM) en agua desionizada, preparando suficiente solución tampón para sumergir completamente los portaobjetos.
- Coloque los portaobjetos en una olla a presión y sométalos a alta temperatura (100 ° C) y presión (~ 30 psi) durante 1 min. Después de calentar, coloque los portaobjetos en agua destilada para que se enfríen a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Realice el bloqueo de la peroxidasa como se describe en el paso 3.
7. Incubación primaria de anticuerpos para la segunda ronda
- Preparar una mezcla de trabajo de los anticuerpos primarios para CD3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon SP7) y CK (anticuerpo monoclonal de ratón, MX005), diluida 1:50 en diluyente de anticuerpos primarios.
- Añadir el complejo de anticuerpos a las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una. Use papel de filtro para alejar el exceso de agua del perímetro del pañuelo, mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.
8. Incubación secundaria de anticuerpos para la segunda ronda
- Preparar una mezcla de anticuerpos anti-conejo de cabra (Ej: 652 nm) y anti-ratón de cabra (Ej: 590 nm), dilución 1:50 en solución salina tampón fosfato. El anticuerpo anti-conejo de cabra se une al anticuerpo primario de CD3, y el anticuerpo anti-ratón de cabra se une al anticuerpo primario de CK.
- Agregue la mezcla de anticuerpos secundarios gota a gota, incube a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una.
9. Extinción por autofluorescencia y tinción DAPI
- Añadir reactivo (0,15 M/L KMnO4) a la sección de tejido durante 1 min. Enjuague con agua corriente durante 5 min.
PRECAUCIÓN: KMnO4 es tóxico y daña la piel. Asegúrese de usar guantes cuando manipule los portaobjetos. Si el líquido gotea sobre la piel, límpialo rápidamente con servilletas limpias y enjuaga con agua corriente. - Seque el portaobjetos con concentraciones crecientes de alcohol (70%, 90%, 100%), durante 3 min en cada concentración.
- Agregue DAPI y cubreobjetos para obtener imágenes multiespectrales. La cantidad de DAPI depende del tamaño del tejido. Asegúrese de que el tejido esté completamente cubierto por DAPI después de agregar el cubreobjetos.
10. Escaneo de diapositivas
- Coloque los portaobjetos en una bandeja y empuje hasta que no se pueda empujar más.
- Para iniciar el programa, haga doble clic en el icono del programa en el escritorio. Durante el arranque, se muestra la ventana de selección de modo. La ventana de selección muestra dos modos de campo claro y fluorescente: modo automático y modo manual. En el modo de escaneo fluorescente, haga clic en Modo automático.
- Mueva el cursor del ratón sobre ? para mostrar la información sobre la configuración. Haga clic en Configuración de filtro > Canal de filtro para elegir el número de canal > Pseudocolor. Defina el color y guárdelo.
- Haga clic en Trabajo rutinario > Modo de escaneo > Completamente automático. Haga clic en Trabajo rutinario > nombre de diapositiva para definir el nombre de diapositiva para la salida. Haga clic en Trabajo rutinario > Configuración de canal para elegir filtros.
- Haga clic en Trabajo rutinario > Opciones de escaneo para determinar la calidad resultante y la ubicación de almacenamiento de la diapositiva virtual.
- Haga clic en Vista previa para establecer el umbral y seleccionar el rango que se va a escanear.
- Haga clic en Hardware > Filtros > Live > Enfoque automático > Exposición automática > Ganancia digital > Marcar usar el tiempo de exposición manual > Marcar limitando el rango > Establecer actual.
- Haga clic en Trabajo rutinario > Iniciar escaneo. Seleccione el nivel de aumento como 20x o 40x. Elija 20x para los tamaños de archivo adecuados. La extensión MRXS está definida por el escáner MIDI Pannoramic 3D. La extensión de imagen también se puede cambiar a imagen TIFF.
- Haga clic en Visor de diapositivas > caja de herramientas Multivista para elegir la imagen para confocal y, a continuación, alinear e integrar la imagen.
11. Evaluación cuantitativa de densidades celulares
- Cuantifique los porcentajes de células inmunitarias positivas (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) en áreas tumorales y de estroma con el software de escáner Halo 10. Validar la tinción de CK para definir el tejido tumoral.
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Representative Results
Presentamos un protocolo para la detección cíclica de antígenos mediante fluorescencia multiplex de 5 colores en un solo portaobjetos. A través de nuestra optimización del ensayo, permitimos la incubación de dos anticuerpos de diferentes especies (Figura 1). Los dispositivos necesarios para el procedimiento experimental incluyen una olla a presión y una caja de inmunotinción (Figura 2A).
Después de completar el ensayo, definimos el pseudo color de los cuatro marcadores antes de escanear los portaobjetos. Los pseudocolores de CD3, CD8, CD20 y CK son amarillo, rojo, verde y cian, respectivamente. Los núcleos están marcados con DAPI. Se seleccionan regiones representativas del tumor y el estroma para su análisis. El espectro fluorescente a 495 nm, 578 nm, 652 nm y 590 nm se captura utilizando un escáner de diapositivas digital automático 3D. En la Figura 2B se muestra una imagen representativa de la pila e imágenes de una sola marca en el tejido de metástasis cerebrales del cáncer de pulmón. Sobre la base de imágenes que contenían una señal de fluorescencia de marcador único, el software del escáner extrajo las características del fenotipo celular en función del pseudocolor. También se contó el número correspondiente de células inmunitarias positivas y células inmunitarias totales. Los niveles de cada proteína teñida se cuantifican en los tejidos detectados mediante el cálculo de la puntuación H12. Después de estos procedimientos, se cuenta y analiza el número de cada tipo de linfocitos infiltrantes del tumor y la proporción de cada tipo de célula en el número total de células diana. La proporción de cada tipo de célula inmune presenta el porcentaje efectivo de linfocitos infiltrantes tumorales. Se analizó el porcentaje de linfocitos T CD3+, CD3+CD8+ y linfocitos B CD20+ en las metástasis cerebrales de cáncer de pulmón en comparación con las secciones primarias de cáncer de pulmón. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3. La densidad de células inmunitarias (linfocitos T CD3+, linfocitos T CD3+ CD8+) es menor en las metástasis cerebrales de cáncer de pulmón que en el cáncer de pulmón primario. Las células B CD20+ son más altas en el grupo de metástasis cerebral que en el grupo de cáncer de pulmón primario. Sin embargo, los resultados no difieren significativamente entre estos dos grupos para las muestras limitadas.
Figura 1: Flujo de trabajo de la tinción inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplexada. Las secciones de 4 μm se cortan y se adhieren en un portaobjetos adhesivo. Se realizan los siguientes pasos operativos: desparafinación y rehidratación, recuperación de antígenos, recuperación de antígenos, bloqueo de antígenos, incubación de mezclas primarias de anticuerpos, incubación secundaria de anticuerpos, luego se repiten los pasos de recuperación de antígenos, bloqueo de antígenos, incubación de mezclas primarias de anticuerpos e incubación secundaria de anticuerpos, seguidas de la reducción de la autofluorescencia, la selección del filtro adecuado para el escaneo de portaobjetos y el análisis de los resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Métodos de operación de la tinción inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple. El tratamiento con antígenos se realiza calentando secciones en una olla a presión. (A) La olla a presión se utiliza para la recuperación de epítopos inducida por calor. En el proceso de incubación de anticuerpos, los portaobjetos se colocan en la caja de inmunotinción. (B) Imágenes compuestas y de tinción única representativas para el panel utilizado en el tejido de metástasis cerebrales de cáncer de pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proporción de células inmunitarias en el cáncer de pulmón primario y en las metástasis cerebrales del cáncer de pulmón. La proporción de células inmunitarias CD3+, CD3+CD8+, CD20+ en cuatro tejidos de metástasis cerebrales de cáncer de pulmón es menor que la de los tejidos de cáncer de pulmón primario pareado (barras de error: desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito el proceso de tinción inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplex. La selección primaria de anticuerpos es un aspecto crucial del ensayo de inmunohistoquímica de fluorescencia, y se recomiendan los anticuerpos monoclonales para una mejor especificidad y repetibilidad. Para optimizar la concentración de trabajo del anticuerpo primario, se han probado una serie de diluciones mediante experimentos de inmunohistoquímica. Tanto los controles positivos (para evaluar la expresión del antígeno diana) como los negativos (sin incubación primaria de anticuerpos) son esenciales y deben establecerse.
En este protocolo, los anticuerpos primarios se diluyen y se preparan para una mezcla de diferentes especies. Los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia también se agrupan e incuban de la misma manera, derivados de diferentes especies. Por lo tanto, el paso crítico es elegir la especie para los diferentes anticuerpos primarios en función de los antígenos, y se prefiere el anticuerpo monoclonal en comparación con el anticuerpo policlonal. Estos pueden garantizar que la combinación entre el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario sea específica. El líquido mezclado debe alcanzar la concentración de trabajo para ambos anticuerpos primarios y no debe existir reactividad cruzada entre los dos anticuerpos simultáneamente. Si los anticuerpos primarios son de la misma especie, primero se incuba un anticuerpo secundario y luego el segundo. Al determinar la secuencia de incubación de anticuerpos primarios en un panel, se debe dar prioridad a los anticuerpos que son sensibles a la reacción antígeno-anticuerpo, para los antígenos de baja expresión, la intensidad se fortalecería durante la recuperación del segundo epítopo. Antes de la segunda ronda de incubación de anticuerpos, la recuperación repetida del antígeno lleva menos tiempo (1 min) en comparación con la primera operación (2 min). La intensidad de fluorescencia de la tinción cíclica previa no disminuirá aunque las secciones se sometan a una recuperación inducida por el calor dos veces. Para evitar la inmunorreactividad inespecífica, es necesario optimizar las condiciones de incubación, incluida la concentración de trabajo de anticuerpos, el tiempo de incubación y la temperatura ambiental.
En las últimas décadas se han desarrollado varios métodos de recuperación de epítopos, divididos principalmente en recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) y recuperación de epítopos inducida por proteasa (PIER). El calentamiento es un método eficiente de recuperación de antígenos que expone los epítopos de antígenos, lo que los hace detectados de manera más efectiva por los anticuerpos13. Las dos opciones principales para la recuperación de antígenos se basan en el tampón citrato y el tampón EDTA de pH alto14. La condición de recuperación optimizada se identifica de acuerdo con el antígeno diana.
La autofluorescencia puede interferir con las imágenes fluorescentes en secciones causadas por fluoróforos y reactivos endógenos utilizados en el procesamiento de tejidos15. Se requiere el uso de un reactivo asociado para la elución. Los fluoróforos se seleccionan con picos de emisión evitando picos de autofluorescencia (alrededor de 490 nm)16,17. Se han descrito casos de negro de Sudán B y NaBH4 para apagar la autofluorescencia tisular18,19. La combinación de Sudan Black B y NaBH4 redujo el fondo de fluorescencia en el tejido renal fijado en formol e incluido en parafina20. En este protocolo, el tratamiento tisular de KMnO4 en una concentración de 0,15 M/L ahorra tiempo durante 1 min. KMnO4 cubre una capa en el tejido para proteger la fluorescencia espontánea y reduce la fluorescencia de fondo, la tinción específica de la proteína detectada se visualiza más.
Las diapositivas completas se escanean en cuatro canales de filtros diferentes, es necesario el análisis de alineación de imágenes, es un gran desafío alinear la localización de estructuras unicelulares y subcelulares. Para obtener imágenes multiespectrales de esta técnica, se necesita un equipo profesional de imágenes de luz y un software de análisis cuantitativo para evitar la diafonía espectral. El alto costo del instrumento limita su aplicación. La co-incubación de dos anticuerpos ahorra tiempo, especialmente cuando se trata de un panel de 6 marcadores, que requiere 3 ciclos de incubación. Esta técnica se utiliza para visualizar una caracterización más detallada de las células inmunitarias en microambientes inmunitarios tumorales. En el futuro, el método se aplicará para el análisis cuantitativo de las estructuras linfoides terciarias asociadas a tumores.
En resumen, la inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplex permite teñir múltiples dianas mediante fluoróforos marcados individualmente en un solo portaobjetos. Este ensayo proporciona una mejor comprensión de la distribución espacial de las células en el microambiente inmunitario tumoral, y la proximidad espacial de las células inmunitarias tumorales contribuye a la detección de pacientes que se beneficiarán de la inmunoterapia.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NO.81860413, 81960455), el Fondo del Departamento de Ciencia y Tecnología de Yunnan (202001AY070001-080), la Fundación de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Yunnan (2019J1274).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
