Multiplex syklisk fluorescerende immunhistokjemi
Summary
Multiplex syklisk immunhistokjemi tillater in situ deteksjon av flere markører samtidig ved bruk av gjentatt antigen-antistoff inkubasjon, bildeskanning og bildejustering og integrasjon. Her presenterer vi operasjonsprotokollen for å identifisere immuncellesubstrater med denne teknologien i lungekreft og parrede hjernemetastaseprøver.
Abstract
Tumormikromiljøet involverer interaksjoner mellom vertsceller, tumorceller, immunceller, stromale celler og vaskulatur. Karakterisering og romlig organisering av immuncelleundergrupper og målproteiner er avgjørende for prognostiske og terapeutiske formål. Dette har ført til utviklingen av multipleksede immunhistokjemiske fargemetoder. Multiplex fluorescens immunhistokjemi tillater samtidig deteksjon av flere markører, noe som letter en omfattende forståelse av cellefunksjon og intercellulære interaksjoner. I denne artikkelen beskriver vi en arbeidsflyt for multiplex syklisk fluorescerende immunhistokjemianalyse og dens anvendelse i kvantifiseringsanalysen av lymfocyttundergrupper. Multiplex syklisk fluorescerende immunhistokjemifarging følger lignende trinn og reagenser som standard immunhistokjemi, som involverer antigengjenfinning, syklisk antistoffinkubasjon og farging på et formalinfast parafininnebygd (FFPE) vevslysbilde. Under antigen-antistoffreaksjonen fremstilles en blanding av antistoffer fra forskjellige arter. Forhold, som antigeninnhentingstid og antistoffkonsentrasjon, optimaliseres og valideres for å øke signal-støy-forholdet. Denne teknikken er reproduserbar og fungerer som et verdifullt verktøy for immunterapiforskning og kliniske applikasjoner.
Introduction
Hjernemetastaser (BM) representerer de vanligste svulstene i sentralnervesystemet (CNS), som forekommer i nesten halvparten av ikke-småcellet lungekreft tilfeller (NSCLC), med dårlig prognose1. Anslagsvis 10%-20% av NSCLC-pasientene har allerede BM på tidspunktet for den første diagnosen, og ca. 40% av NSCLC-tilfellene vil utvikle BM i løpet av behandlingen2. Tumormikromiljøet (TME) er nært forbundet med NSCLC-forekomst og BM, inkludert forskjellige komponenter, for eksempel blodkar, fibroblaster, makrofager, ekstracellulær matrise (ECM), lymfoid, benmargsavledede immunceller og signalmolekyler 3,4. Mikromiljømessige immunceller spiller en avgjørende rolle i å påvirke kreftcellevekst og utvikling. Hjernemetastaser presenterer mange potensielle behandlingsmål preget av komplekse immunologiske mikromiljøer og signalprosesser. For eksempel har PD-1-hemmere vist klinisk effekt for pasienter med lungekreft hjernemetastase (LCBM) som en immunkontrollpunkthemmer (ICI). Imidlertid varierer responsfrekvensen på PD-1-terapi mellom primær NSCLC og LCBM5, noe som tyder på at tumorimmunmikromiljøet fungerer som en kritisk ICI-regulator.
Immunhistokjemi (IHC) er et uvurderlig verktøy innen biologi, grunnmedisin og patologi6. Denne deteksjonsmetoden visualiserer antigenuttrykk gjennom samspillet mellom antigen-antistoff på et vevslysbilde7. IHC brukes til å diagnostisere prediktive markører, evaluere prognostiske markører, veilede målrettede terapier og utforske tumorcellers biologiske funksjoner8. Den tradisjonelle IHC-metoden kan imidlertid bare oppdage én biomarkør om gangen. For å møte denne begrensningen har innovasjonen av immunhistokjemisk teknologi ført til utviklingen av multiplex fluorescens immunhistokjemi (mfIHC), som muliggjør samtidig identifisering av flere proteinmarkører på samme vevslysbilde, både i lyse felt og fluorescerende felt9. Denne fremgangen gir nøyaktig analyse av cellesammensetning og molekylære interaksjoner mellom stromale celler, immunceller og kreftceller i TME.
I denne studien presenterer vi en protokoll for multiplex syklisk immunhistokjemi for å analysere den romlige fordelingen av immunceller. To primære antistoffer av forskjellige arter, som kanin og rotte, velges for inkubering samtidig, etterfulgt av fluorescensmerkede sekundære antistoffer. Antigenuthenting utføres etter hver runde med antigen-antistoffreaksjon. Autofluorescens er blokkert, og 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) brukes til farging av kjernene. Panelet inkluderer sekvensiell påvisning av CD3, CD8, CD20 og CK, celler er kategorisert i henhold til markørene: tumorceller (CK+), modne T-celler (CD3+), cytotoksiske T-celler (CD3+CD8+), B-celler (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet prosessen for multiplex syklisk fluorescens immunhistokjemi farging. Det primære antistoffvalget er et avgjørende aspekt ved fluorescensimmunhistokjemianalysen, og monoklonale antistoffer anbefales for bedre spesifisitet og repeterbarhet. For å optimalisere arbeidskonsentrasjonen av det primære antistoffet, har en rekke fortynninger blitt testet gjennom immunhistokjemiske eksperimenter. Både positive kontroller (for å vurdere målantigenuttrykk) og negative kontroller (ingen primær antistoffinkuba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
