多重环状荧光免疫组化
Summary
多重循环免疫组化允许使用重复抗原抗体孵育、图像扫描以及图像比对和整合同时原 位 检测多个标记物。在这里，我们介绍了使用该技术在肺癌和配对脑转移样本中鉴定免疫细胞底物的操作方案。
Abstract
肿瘤微环境涉及宿主细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和脉管系统之间的相互作用。表征和空间组织免疫细胞亚群和靶蛋白对于预后和治疗目的至关重要。这导致了多重免疫组化染色方法的发展。多重荧光免疫组化可同时检测多种标志物，有助于全面了解细胞功能和细胞间相互作用。在本文中，我们描述了多重环荧光免疫组织化学测定的工作流程及其在淋巴细胞亚群定量分析中的应用。多重荧光免疫组化染色遵循与标准免疫组化类似的步骤和试剂，包括抗原修复、环状抗体孵育和福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织载玻片上的染色。在抗原-抗体反应过程中，制备来自不同物种的抗体混合物。优化和验证抗原回收时间和抗体浓度等条件，以提高信噪比。该技术是可重复的，可作为免疫治疗研究和临床应用的宝贵工具。
Introduction
脑转移瘤 （BM） 是最常见的中枢神经系统 （CNS） 肿瘤，发生在近一半的非小细胞肺癌 （NSCLC） 病例中，预后不良1。据估计，10%-20% 的 NSCLC 患者在初始诊断时已经患有 BM，大约 40% 的 NSCLC 病例将在治疗过程中发生 BM2。肿瘤微环境 （TME） 与 NSCLC 的发生和 BM 密切相关，包括各种成分，如血管、成纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质 （ECM）、淋巴样、骨髓来源的免疫细胞和信号分子 3,4。微环境免疫细胞在影响癌细胞生长发育方面起着至关重要的作用。脑转移瘤具有许多潜在的治疗靶点，其特征是复杂的免疫微环境和信号传导过程。例如，PD-1 抑制剂作为免疫检查点抑制剂 （ICI） 已显示出对肺癌脑转移 （LCBM） 患者的临床疗效。然而，原发性 NSCLC 和 LCBM5 对 PD-1 治疗的反应频率不同，这表明肿瘤免疫微环境充当关键的 ICI 调节因子。
免疫组化 （IHC） 是生物学、基础医学和病理学领域的宝贵工具6.该检测方法通过抗原-抗体在组织载玻片上的相互作用来可视化抗原表达7。IHC 用于诊断预测标志物、评估预后标志物、指导靶向治疗和探索肿瘤细胞的生物学功能8。然而，传统的 IHC 方法一次只能检测一种生物标志物。为了解决这一局限性，免疫组织化学技术的创新导致了多重荧光免疫组织化学 （mfIHC） 的发展，它允许在同一组织载玻片上同时识别多个蛋白质标记物，包括明场和荧光场9。这一进展提供了对 TME 内基质细胞、免疫细胞和癌细胞之间的细胞组成和分子相互作用的准确分析。
在这项研究中，我们提出了一种多重环状免疫组织化学方案，以分析免疫细胞的空间分布。同时选择兔和大鼠等两种不同物种的一抗进行孵育，然后进行荧光标记的二抗。抗原修复在每轮抗原抗体反应后进行。阻断自发荧光，并使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。该panel包括CD3、CD8、CD20和CK的顺序检测，细胞根据标记物分类：肿瘤细胞（CK+）、成熟T细胞（CD3+）、细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）、B细胞（CD20+）10,11。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们已经描述了多重环状荧光免疫组化染色的过程。一抗选择是荧光免疫组化测定的一个关键方面，建议使用单克隆抗体以获得更好的特异性和可重复性。为了优化一抗的工作浓度，通过免疫组化实验测试了一系列稀释液。阳性对照（评估靶抗原表达）和阴性对照（无一抗孵育）都是必不可少的，应进行设置。
在该方案中，一抗被稀释并制备为来自不同物种的混合物。荧光?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究得到了国家自然科学基金（NO.81860413,81960455）、云南省科技厅基金（202001AY070001-080）、云南省教育厅科研基金（2019J1274）的支持。
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
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