マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学
Summary
マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ で検出することができます。ここでは、肺癌および対の脳転移サンプルにおいて、この技術を用いて免疫細胞の基質を同定するための操作プロトコルを紹介します。
Abstract
腫瘍微小環境には、宿主細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞、および血管系の間の相互作用が含まれます。免疫細胞のサブセットと標的タンパク質を特徴づけ、空間的に組織化することは、予後および治療の目的にとって非常に重要です。これにより、マルチプレックス免疫組織化学染色法が開発されました。マルチプレックス蛍光免疫組織化学は、複数のマーカーの同時検出を可能にし、細胞機能と細胞間相互作用の包括的な理解を促進します。この論文では、マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学アッセイのワークフローと、リンパ球サブセットの定量分析におけるその応用について説明します。マルチプレックス環状蛍光免疫組織化学染色は、抗原賦活化、環状抗体インキュベーション、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織スライドでの染色など、標準的な免疫組織化学と同様の手順と試薬に従います。抗原抗体反応中に、異なる種からの抗体の混合物が調製されます。抗原賦活化時間や抗体濃度などの条件が最適化され、検証され、S/N比が向上します。この技術は再現性があり、免疫療法の研究や臨床応用のための貴重なツールとして機能します。
Introduction
脳転移(BM)は最も一般的な中枢神経系(CNS)腫瘍であり、非小細胞肺がん(NSCLC)症例のほぼ半数に発生し、予後不良である1。NSCLC患者の推定10%〜20%は、初期診断時にすでにBMを患っており、NSCLC症例の約40%は治療の過程でBMを発症します2。腫瘍微小環境(TME)は、血管、線維芽細胞、マクロファージ、細胞外マトリックス(ECM)、リンパ球、骨髄由来免疫細胞、シグナル伝達分子などのさまざまな構成要素を含む、NSCLCの発生およびBMと密接に関連しています3,4。微小環境免疫細胞は、がん細胞の増殖と発達に影響を与える上で重要な役割を果たします。脳転移は、複雑な免疫学的微小環境とシグナル伝達プロセスを特徴とする多数の潜在的な治療標的を提示します。例えば、PD-1阻害剤は、肺がん脳転移(LCBM)患者に対して、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)として臨床効果を示しています。しかしながら、PD-1療法に対する反応の頻度は、原発性NSCLCとLCBM5の間で異なり、腫瘍免疫微小環境が重要なICI調節因子として作用することが示唆されている。
免疫組織化学(IHC)は、生物学、基礎医学、病理学の分野で非常に貴重なツールです6。この検出法は、組織スライド上の抗原抗体の相互作用を通じて抗原発現を可視化する7。IHCは、予測マーカーの診断、予後マーカーの評価、標的療法の指導、腫瘍細胞の生物学的機能の調査に使用されます8。しかし、従来のIHC法では、一度に1つのバイオマーカーしか検出できません。この限界に対処するために、免疫組織化化学技術の革新により、明視野と蛍光野の両方で、同じ組織スライド上の複数のタンパク質マーカーを同時に同定できるマルチプレックス蛍光免疫組織化学(mfIHC)が開発されました9。この進歩により、TME内の間質細胞、免疫細胞、およびがん細胞間の細胞組成と分子相互作用の正確な分析が可能になります。
本研究では、免疫細胞の空間分布を解析するためのマルチプレックスサイクリック免疫組織化学のプロトコルを提示する。ウサギとラットなどの異なる種の2つの一次抗体を同時にインキュベーション用に選択し、続いて蛍光標識した二次抗体を選択します。抗原賦活化は、抗原抗体反応の各ラウンドの後に行われます。自家蛍光をブロックし、4′, 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて核を染色します。このパネルには、CD3、CD8、CD20、およびCKの連続検出が含まれており、細胞はマーカーに従って分類されます:腫瘍細胞(CK+)、成熟T細胞(CD3+)、細胞傷害性T細胞(CD3 + CD8 +)、B細胞(CD20 +)10,11。
Protocol
Representative Results
Discussion
マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学染色のプロセスについて説明しました。一次抗体の選択は、蛍光免疫組織化学アッセイの重要な側面であり、特異性と再現性を向上させるためにモノクローナル抗体が推奨されます。一次抗体の使用濃度を最適化するために、免疫組織化学実験を通じて一連の希釈液を試験しました。ポジティブコントロール(標的抗原発現を評価するため)と?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(NO.81860413、81960455)、雲南省科学技術部基金(202001AY070001-080)、雲南省教育部科学研究財団(2019J1274)の支援を受けました。
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
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