Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie
Summary
Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.
Abstract
De micro-omgeving van de tumor omvat interacties tussen gastheercellen, tumorcellen, immuuncellen, stromale cellen en vasculatuur. Het karakteriseren en ruimtelijk organiseren van subsets van immuuncellen en doeleiwitten is cruciaal voor prognostische en therapeutische doeleinden. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van multiplexed immunohistochemie kleuringsmethoden. Multiplex-fluorescentie-immunohistochemie maakt de gelijktijdige detectie van meerdere markers mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van de celfunctie en intercellulaire interacties mogelijk wordt. In dit artikel beschrijven we een workflow voor de multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemietest en de toepassing ervan in de kwantificeringsanalyse van lymfocytensubsets. De multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemische kleuring volgt vergelijkbare stappen en reagentia als standaard immunohistochemie, waarbij antigeenextractie, cyclische antilichaamincubatie en kleuring op een in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefselglaasje betrokken zijn. Tijdens de antigeen-antilichaamreactie wordt een mengsel van antilichamen van verschillende soorten bereid. Omstandigheden, zoals de ophaaltijd van het antigeen en de concentratie van antilichamen, worden geoptimaliseerd en gevalideerd om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Deze techniek is reproduceerbaar en dient als een waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar immunotherapie en klinische toepassingen.
Introduction
Hersenmetastasen (BM) vertegenwoordigen de meest voorkomende tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) en komen voor in bijna de helft van de gevallen van niet-kleincellige longkanker (NSCLC), met een slechte prognose1. Naar schatting 10%-20% van de NSCLC-patiënten heeft al BM op het moment van de eerste diagnose, en ongeveer 40% van de NSCLC-gevallen zal BM ontwikkelen in de loop van behandeling2. De tumormicro-omgeving (TME) is nauw verbonden met het voorkomen van NSCLC en BM, inclusief verschillende componenten, zoals bloedvaten, fibroblasten, macrofagen, extracellulaire matrix (ECM), lymfoïde, van beenmerg afgeleide immuuncellen en signaalmoleculen 3,4. Micro-omgevingsimmuuncellen spelen een cruciale rol bij het beïnvloeden van de groei en ontwikkeling van kankercellen. Hersenmetastasen presenteren tal van potentiële behandelingsdoelen die worden gekenmerkt door complexe immunologische micro-omgevingen en signaleringsprocessen. PD-1-remmers hebben bijvoorbeeld klinische werkzaamheid aangetoond voor patiënten met hersenmetastasen van longkanker (LCBM) als immuuncheckpointremmer (ICI). De frequentie van reacties op PD-1-therapie varieert echter tussen primaire NSCLC en LCBM5, wat suggereert dat de immuunmicro-omgeving van de tumor fungeert als een kritische ICI-regulator.
Immunohistochemie (IHC) is een hulpmiddel van onschatbare waarde op het gebied van biologie, basisgeneeskunde en pathologie6. Deze detectiemethode visualiseert antigeenexpressie door de interactie van antigeen-antilichaam op een weefselglaasje7. IHC wordt gebruikt voor het diagnosticeren van voorspellende markers, het evalueren van prognostische markers, het begeleiden van gerichte therapieën en het onderzoeken van de biologische functies van tumorcellen8. De traditionele IHC-methode kan echter maar één biomarker tegelijk detecteren. Om deze beperking aan te pakken, heeft de innovatie van immunohistochemische technologie geleid tot de ontwikkeling van multiplex fluorescentie immunohistochemie (mfIHC), die de gelijktijdige identificatie van meerdere eiwitmarkers op hetzelfde weefselglaasje mogelijk maakt, zowel in het heldere veld als in het fluorescerende veld9. Deze vooruitgang biedt een nauwkeurige analyse van de celsamenstelling en moleculaire interacties tussen stromale cellen, immuuncellen en kankercellen binnen de TME.
In deze studie presenteren we een protocol voor multiplex cyclische immunohistochemie om de ruimtelijke verdeling van immuuncellen te analyseren. Twee primaire antilichamen van verschillende soorten, zoals konijn en rat, worden tegelijkertijd gekozen voor incubatie, gevolgd door fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen. Het ophalen van antigeen wordt uitgevoerd na elke antigeen-antilichaamreactie. Autofluorescentie wordt geblokkeerd en 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) wordt gebruikt voor het kleuren van de kernen. Het panel omvat sequentiële detectie van CD3, CD8, CD20 en CK, cellen worden gecategoriseerd volgens de markers: tumorcellen (CK+), rijpe T-cellen (CD3+), cytotoxische T-cellen (CD3+CD8+), B-cellen (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben het proces beschreven voor multiplex cyclische fluorescentie immunohistochemische kleuring. De selectie van primaire antilichamen is een cruciaal aspect van de fluorescentie-immunohistochemische test, en monoklonale antilichamen worden aanbevolen voor een betere specificiteit en herhaalbaarheid. Om de werkconcentratie van het primaire antilichaam te optimaliseren, is een reeks verdunningen getest door middel van immunohistochemische experimenten. Zowel positieve controles (om de expressie van het doelantigeen t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department van de provincie Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
