Summary
3D-utskrift på mikrometerskala möjliggör snabb prototypframställning av polymera enheter för neuronala cellkulturer. Som ett principbevis begränsades strukturella kopplingar mellan neuroner genom att skapa barriärer och kanaler som påverkade neuritutväxt, medan de funktionella konsekvenserna av sådan manipulation observerades av extracellulär elektrofysiologi.
Abstract
Neuronala kulturer har varit en experimentell referensmodell i flera decennier. 3D-cellarrangemang, rumsliga begränsningar för neuritutväxt och realistisk synaptisk konnektivitet saknas dock. Det senare begränsar studiet av struktur och funktion i samband med kompartmentalisering och minskar betydelsen av kulturer inom neurovetenskapen. Att approximera ex vivo det strukturerade anatomiska arrangemanget av synaptisk konnektivitet är inte trivialt, trots att det är nyckeln till uppkomsten av rytmer, synaptisk plasticitet och i slutändan hjärnans patofysiologi. Här används tvåfotonpolymerisation (2PP) som en 3D-utskriftsteknik, vilket möjliggör snabb tillverkning av polymera cellodlingsenheter med polydimetyl-siloxan (PDMS) i mikrometerskala. Jämfört med konventionella replikformningstekniker baserade på mikrofotolitografi möjliggör 2PP-utskrift i mikroskala snabb och prisvärd vändning av prototyper. Detta protokoll illustrerar design och tillverkning av PDMS-baserade mikrofluidiska enheter som syftar till att odla modulära neuronala nätverk. Som ett principbevis presenteras en tvåkammarenhet för att fysiskt begränsa anslutningen. Specifikt gynnas en asymmetrisk axonal utväxt under ex vivo-utveckling och tillåts ledas från en kammare till en annan. För att undersöka de funktionella konsekvenserna av enkelriktade synaptiska interaktioner väljs kommersiella mikroelektrodarrayer för att övervaka den bioelektriska aktiviteten hos sammankopplade neuronala moduler. Här illustreras metoder för att 1) tillverka formar med mikrometerprecision och 2) utföra in vitro extracellulära registreringar på flera platser i kortikala neuronala kulturer hos råtta. Genom att minska kostnaderna och den framtida utbredda tillgängligheten av 2PP 3D-utskrifter kommer denna metod att bli mer och mer relevant i forskningslaboratorier över hela världen. Speciellt inom neuroteknik och neural dataregistrering med hög genomströmning kommer enkelheten och snabbheten i prototyper förenklade in vitro-modeller att förbättra experimentell kontroll och teoretisk förståelse av storskaliga neurala system in vivo .
Introduction
Att undersöka neuronal aktivitet i organismer som beter sig innebär flera utmaningar. Till exempel begränsas den fysiska tillgången till hjärnvävnaden av behovet av att upprätthålla dess integritet, så hjärnans ytliga regioner är lättare att ta hänsyn till. Att isolera specifika mål i den intakta vävnaden är ofta en skrämmande uppgift och ibland omöjligt. Även om dissocierade homogena neuronala kulturer erbjuder bekväm tillgång till de molekylära, biokemiska och biofysiska egenskaperna hos enskilda (sub)cellulära komponenter i en neural krets, går en realistisk konnektivitet och anatomisk organisation av den intakta hjärnan förlorad. Dessa grundläggande begränsningar inspirerade forskningsinsatser för att uppnå en medelväg, där in vivo-komplexitet undviks medan strukturen kan konstrueras in vitro, vilket är på begäran 1,2,3,4,5,6,7,8,9. I synnerhet har modulära neuronala kulturer varit föremål för omfattande forskning under de senaste decennierna, som syftar till att ta itu med nyckelfrågor inom hjärnans fysiologi som beskrivs nedan.
Organisation: In vivo-studier visar att hjärnan är anatomiskt uppbyggd i lager med exakta celltyper och matriser av projektioner. Funktionella analyser avslöjade organisationen av de neuronala nätverken i nodsammansättningar och moduler, med exakta anslutningsscheman10,11. Konnektivitets- och mikrokretsmotivens roll kan dock inte studeras tillräckligt in vivo på grund av det stora antalet synapser som är inblandade, liksom de sammanvävda effekterna av utveckling och aktivitetsberoende plasticitet.
Signalöverföring: I in vivo - eller slumpmässiga in vitro-odlingar är det svårt att bedöma signalöverföringen. Att undersöka axonal lednings- och aktionspotential längs dess längd kräver att man vägleder neuritutväxten genom ytfunktionalisering eller kemisk mönstring, vilket ger ett högt signal-brusförhållande i extracellulära avläsningar av elektrisk aktivitet12.
Translationell relevans: Att dechiffrera den exklusiva rollen för pre- kontra postsynaptiska element över patologiska tillstånd kräver att man har tillgång till dessa element individuellt. Modulära kulturer med begränsad konnektivitet, som effektivt separerar de pre- och postsynaptiska elementen, är oumbärliga verktyg för detta ändamål13.
Det finns flera metoder för att få någon form av struktur i neuronal odling. De kan i stort sett kategoriseras som kemisk och fysisk ytmanipulation9. De förstnämnda metoderna14,15 bygger på neuronala cellers benägenhet att binda till vissa (bio)kemiska föreningar. Detta kräver att man deponerar lim eller attraktiva molekyler på en yta med mikroskala precision och följer ett detaljerat mönster. Även om detta möjliggör en partiell täckning av cellernas yta, enligt det önskade mönstret, är kemiska metoder till sin natur begränsade och har en relativt låg framgångsfrekvens i neurittillväxtvägledning16. Full kontroll över axonriktningen kräver att man upprättar en rumslig gradient av ad-hoc-kemikalier för att forma axonal vägledning17. De senare metoderna involverar fysisk ytmanipulation och används oftare för att strukturera de neuronala nätverken in vitro. Neuronala celler är fysiskt begränsade på önskade platser av geometriska inneslutningar, såsom mikroskopiska kammare, väggar, kanaler, etc., vilket formar en biokompatibel polymer såsom polydimetylsiloxan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 härdad och stelnad till en mikrofluidisk anordning. De facto-metoden för PDMS-mikrofluidisk tillverkning är mjuk fotolitografi21, där en tvådimensionell mask mönstras i mikroskala och används för att selektivt etsa ett kiselbaserat material vid UV-exponering. I ett nötskal beläggs ett UV-härdbart harts (dvs. fotoresist) på en kiselskiva genom spinnbeläggning och når en specifik höjd som bestäms av dess viskositet och centrifugeringshastighet. Sedan placeras den mönstrade masken över fotoresisten och utsätts för UV-ljus. Genomskinliga områden i masken, som motsvarar intressanta områden, låter UV-ljus inducera lokaliserad tvärbindning av fotoresistmolekylerna. Områdena med oexponerad fotoresist tvättas bort med ett lösningsmedel, vilket resulterar i bildandet av en masterform. Detta används upprepade gånger för att baka en valfri elastomer (dvs. PDMS), som sedan graveras med önskade geometrier i så många kopior som önskas. En sådan tillverkningsmetod är den vanligaste metoden för att tillverka mikrofluidiska enheter22. De kanske största begränsningarna med mjuk fotolitografi är förutsättningen för anmärkningsvärda kapitalinvesteringar och de biologiska laboratoriernas okunskap om de tekniker och den expertis som krävs. Beredningen av masken och de steg i mjuk fotolitografi som krävs för att designa komplexa geometrier med flera höjder och högt bildförhållande är icke-triviala23 och kräver ofta outsourcing. Även om alternativa metoder och lågbudgetmetoder har föreslagits, uppfyller de inte alltid de krav på hög precision som ställs vid biologisk prototypframställning24.
Här presenteras en alternativ tillverkningsmetod som bygger på tvåfotonpolymerisation (2PP) och additiv tillverkning. Det är enkelt och kräver i sig ingen avancerad expertis inom mikrofabrikation och mikrofotolitografi. Forskningsområdet 2PP mikrotillverkning uppstod i slutet av 90-talet25, och sedan dess har det bevittnat exponentiell tillväxt26. Mer om de grundläggande principerna för denna teknik finns på annan plats26. Kortfattat, genom att fokusera excitationsljusimpulsen i det tredimensionella rummet, utnyttjar 2PP det icke-linjära beroendet av multifotonabsorption på intensitet. Detta ger möjlighet till begränsad absorption, vilket säkerställer exakt och selektiv excitation inom mycket lokala regioner. I huvudsak utsätts en fotoresist med negativ ton, ett material med minskad löslighet vid ljusexponering, för en fokuserad stråle av femtosekundlaserpulser vid en låg arbetscykel27. Detta möjliggör impulser med hög intensitet vid låga medeleffekter, vilket möjliggör polymerisation utan att skada materialet. Interaktionen mellan fotoinducerade radikalmonomerer ger upphov till radikaloligomerer, som initierar polymerisation som sträcker sig genom fotoresisten upp till en distinkt volym, dvs voxel, vars storlek beror på intensiteten och varaktigheten av laserpulserna28.
I detta arbete presenteras två komponenter: A) design och snabb tillverkning av en 3D-printad form, som kan återanvändas många gånger för att producera engångspolymera neuronala cellodlingsenheter (Figur 1), och B) deras mekaniska koppling på ytan av plana neuronala cellodlingssubstrat, eller till och med av substratintegrerade mikroelektrodmatriser som kan spela in bioelektriska signaler på flera platser.
Datorstödd design av en mekanisk 3D-modell beskrivs mycket kortfattat här och tillsammans med stegen som leder till en 3D-printad form och tillverkning av PDMS-enheter beskrivs också i detalj.
En mängd olika datorstödda designprogram kan användas för att generera den startande 3D-objektmodellen och producera en STL-fil för att styra 2PP-utskriftsprocessen. I materialtabellen är de första och sista applikationerna som listas gratis eller försedda med en gratis licens. Att konstruera en 3D-modell kräver alltid att man skapar en 2D-skiss, som sedan extruderas i efterföljande modelleringssteg. För att demonstrera detta koncept lyfts en generisk 3D CAD-programvarudesignprocess fram i protokollavsnittet, vilket leder till en struktur gjord av överlappande kuber. För mer omfattande information finns ett antal onlinehandledningar och kostnadsfria utbildningsresurser tillgängliga, som anges i materialförteckningen.
Den resulterande STL-filen översätts sedan till en serie kommandon som ska utföras av 3D-skrivaren (dvs. skivningsprocedur). För den specifika 2PP 3D-skrivaren som används används programvaran DeScribe för att importera STL-filen och konvertera den till det proprietära formatet General Writing Language (GWL). Framgången för 2PP-utskriftsprocessen beror på olika parametrar, särskilt laserkraft och dess skanningshastighet, sömnad och kläcknings-skivningsavstånd. Valet av dessa parametrar, tillsammans med valet av objektiv och fotoresist, beror på designens minsta egenskaper, såväl som den avsedda applikationen. Således blir parameteroptimering avgörande för att uppfylla kraven i olika designscenarier och användningsfall. För detta arbete har det rekommenderade receptet IP-S 25x ITO Shell (3D MF) övervägts som en konfiguration för utskriftsparametrarna. I slutändan skrivs en mekaniskt stabil tryckt del ut med den nödvändiga upplösningen samtidigt som 3D-utskriftstiden minimeras.
Formdesignen och den relaterade STL-filen, som demonstreras i detta arbete, består av en kvadratisk ram för att separera utrymmet för en cellkultur i två fack: ett yttre område (dvs. kallat Source senare) och ett inre område (dvs. kallat Target senare). Dessa två fack är sammankopplade genom uppsättningar av mikrokanaler, var och en kännetecknad av skarpa vinkelkanter, utformade för att specifikt hindra tillväxten av neuriter från målet till källan, men inte vice versa, och som sådan främja en riktad synaptisk anslutning mellan neuroner som växer på de två områdena.
Tidigare studier använde olika geometrier av mikrokanaler för att uppmuntra riktad tillväxt av neuriter. Exempel är triangulära former18, kanaltaggiga strukturer19 och avsmalnande kanaler20. Här används en design med skarpa vinkelbarriärer över mikrokanalens gränser, som också kännetecknas av asymmetriska ingångar. Dessa mikrokanaler tjänar till att skapa kontinuitet mellan en sluten inre, målfacket, och det yttre området, källfacket. Trattformen på den första delen av mikrokanalerna, från källsidan, är utformad för att främja bildandet av axonala buntar och deras tillväxt längs den kortaste, dvs. raka linjen, vägen som förbinder källan med målet. Det triangulära rummet som realiseras genom att vända skarpa vinklar har större volym på målsidan för att effektivt fördröja neuriternas vägfinnande samtidigt som det gynnar snabb fotografering av buntar som härrör från källan och ockupation av det tillgängliga utrymmet. Valet av 540 μm för mikrokanalernas längd filtrerar effektivt bort den generellt kortare dendritiska utväxten39. Dessutom hindrar deras höjd på 5 μm cellsomata från att tränga igenom mikrokanalerna. Sammantaget visade sig den här konfigurationen främja enkelriktad anslutning mellan de yttre modulerna, Source och inre Target-modulerna, och den presenteras här som ett principbevis bland de många alternativa alternativen.
Medan PDMS-enheterna, tillverkade av 2PP-formen, kan fästas på ytan av vanliga cellodlingssubstrat, såsom glastäcken eller petriskålar, användes i detta arbete kommersiellt tillgängliga substratintegrerade mikroelektrodmatriser. Inga ansträngningar har gjorts för att optimera 3D-designen till mikroelektrodmatrisens layout, och den mekaniska kopplingen utfördes under stereomikroskopivägledning som endast syftade till att placera enheten över arrayen, vilket lämnade en del mikroelektrod avtäckt på båda sidor, källan och målet. Detta möjliggör en preliminär bedömning av de funktionella konsekvenserna av den begränsade konnektiviteten i neuronala cellkulturer.
Protocol
Alla förfaranden som involverade djurhantering utfördes i enlighet med europeisk och italiensk lagstiftning (Europaparlamentets och rådets direktiv av den 22 september 2010 [2010/63/EU]; Italienskt regeringsdekret av den 4 mars 2014, nr 26), godkändes uttryckligen av den institutionella OpBA (kommittén för djurvård) vid Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati och godkändes officiellt av det italienska hälsoministeriet (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Dessa ledde till att icke-kännande material från den explanterade hjärnvävnaden från råttor blev tillgängligt, för att användas för experimentell validering av metoden som presenteras i detta arbete.
1. 3D formtillverkning genom tvåfotonpolymerisation
- Generera CAD-filer
OBS: Följande steg demonstrerar ett generiskt arbetsflöde för 3D-design med hjälp av datorstödd designprogramvara (t.ex. SolidWorks). Exemplet på STL-designfilen som beskrivs i detta arbete (figur 2) finns tillgänglig som kompletterande kodningsfil 1, samt via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).- Starta skrivbordsprogrammet för datorstödd designprogramvara. På den översta menyraden väljer du Ny.
- Från alternativen väljer du Del: en 3D-representation av en enskild designkomponent. Tryck på tangentkombinationen Ctrl + 5 för att visa skissens ovansida.
- På sidopanelen väljer du Skissa och sedan Hörnrektangel. Välj en kant av rektangeln genom att klicka på den. När en parameterpanel visas ställer du in längden till 100 enheter.
- Upprepa steg 1.1.3 för kanten vinkelrätt mot den föregående: ställ in dess längd till 50 enheter. Markera rektangeln genom att dra över den samtidigt som du håller ned vänster musknapp.
- På menyn Lägg till relation väljer du Korrigera för att begränsa relationerna mellan linjerna.
- Avsluta skissen och upprepa steg 1.1.3 till 1.1.5 och skapa en ny (mindre) rektangel som överlappar den föregående skissen.
- Från sidopanelen väljer du Funktioner och sedan Extruderad knopp/bas: ställ in djupet på både de stora och små rektanglarna till 5 respektive 10 enheter.
- Från Arkiv-menyn sparar du delen i STL-format (dvs. Standard Tessellation Language).
- Bearbetning av CAD-filer
- Överför STL-filen till en persondator som är utrustad med programmet DeScribe.
- Starta Beskriv och öppna STL-filen från Arkiv-menyn. En 3D-representation av modellen visas.
- Från orienteringsavsnittet på menyn till höger roterar du modellen för att orientera den på lämpligt sätt i rymden och centrera den i planet.
- Justera den övergripande skalningen genom att välja avsnittet Skalning i menyn till höger.
- I rullgardinsmenyn högst upp väljer du receptet IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Detta specificerar IP-S som fotoresist, 25x för objektivets förstoringseffekt, Indium Tin Oxide (ITO) belagt substrat som trycksubstrat och skal- och ställningstryck som driftläge med medelstora funktioner (MF).
- Navigera genom guiden, välj och ställ in Skäravstånd till 1 μm och Skrafveringsavstånd till 0,5 μm för både skalet och ställningen.
- I utmatningssteget i importguiden, under delning, definierar du blockstorleken som X = 200 μm, Y = 200 μm och Z = 265 μm och blockförskjutningen som X = 133 μm, Y = 133 μm och Z = 0, och ser till att mikrokanalernas känsliga strukturer inte påverkas av stygnlinjerna.
- Som skanningsläge använder du standardinställningen: Galvo för X-Y-planet och Piezo för Z-axeln.
- Tryck på Spara och ersätt raden var $baseLaserPower = $shellLaserPower med var $baseLaserPower = 75 i nästa textmeny för att minska lasereffekten vid utskriftens lägsta lager till 75 %.
- Överför GWL-filerna som erhållits genom ovanstående steg till arbetsstationen som är dedikerad för 2PP 3D-utskrift.
- 3D-utskrift och provutveckling
- Starta applikationsprogrammet NanoWrite . Efter skrivarinitiering klickar du på Exchange Holder i programvarugränssnittet för att sätta in substrathållaren och montera objektivet.
- Montera 25x-objektivet i lämpligt läge på nosstycket. Identifiera vilken sida av glassubstratet som är belagd med ITO, med en elektronisk multimeter inställd för att mäta resistanser: avläsningen bör vara låga värden, såsom 100-300 Ω, men endast för den ITO-belagda sidan.
- Placera glassubstratet på hållaren och orientera den ITO-belagda sidan uppåt. Använd tejp för att hålla den stadigt på plats.
- Under det kemiska dragskåpet, applicera en droppe IP-S-fotoresist i mitten av glassubstratet.
- Sätt i hållaren i 3D-skrivaren, med hartsdroppen vänd mot objektivet (dvs. nedåt).
- Ladda GWL-filerna via programvarans Arkiv-meny . Välj Approach Sample för att flytta objektivet nära hartsdroppen.
- Välj Sök gränssnitt för att tillåta detektering av ITO-fotoresistutskriftsgränssnittet, baserat på skillnaden i brytningsindex för de två materialen.
- Välj Starta jobb för att starta utskriften. När utskriften är klar trycker du på Exchange-hållaren för att hämta hållaren.
- Ta fram hållaren och ta försiktigt bort substratet med den tryckta delen. Sänk ner glassubstratet i propylenglykolmetyleteracetat (PGMEA) i 20 minuter under dragskåpet för att framkalla den tryckta delen.
- Ta bort substratet från PGMEA och sänk ner det i isopropanol i 5 minuter. Låt den tryckta delen lufttorka, under det kemiska dragskåpet.
- Post-print-behandling och formmontering
- Härda den utskrivna delen genom exponering för UV-ljus (dvs. 365-405 nm) med tillräcklig effekt i 5-20 minuter (se Diskussion för strömdetaljer).
- Under en huv med laminärt flöde, ta försiktigt bort den tryckta delen från glassubstratet. Släpp ~2 μL harts i botten av en petriskål på 35 mm x 10 mm.
- Placera försiktigt den tryckta delen över droppen och låt hartset rinna under delen. Härda den tryckta delen ytterligare genom exponering för UV-ljus, i 5 min.
- Täck petriskålen med locket och sätt in den i ugnen för värmehärdning, över 30 minuter vid 80 °C. Förvärm inte ugnen för att undvika deformation eller brott på den tryckta delen. Efter härdning kommer den tryckta delen att fästas permanent på botten av petriskålen. Från och med nu kommer den tryckta och monterade delen att kallas mögel.
2. Tillverkning av PDMS-enheter från form- och cellodlingssubstrat
- Tillverkning av PDMS-enheter
- Bered 20 ml 10:1 (viktförhållande) blandning av basen ochhärdaren av opolymeriserad PDMS. För varje enhet, och beroende på önskad höjd, räcker det med 1-2 ml PDMS-blandning. Förvara överskottet av opolymeriserad PDMS vid -20 °C för senare användning.
- Rör om blandningen ordentligt under en huv med laminärt flöde i 4 minuter. Eftersom blandningen fångar luftbubblor jämnt blir den ogenomskinlig.
- Överför blandningen till ett 50 μL μrör och centrifugera den vid 168 x g i 5 minuter för att eliminera luftbubblor från blandningen och uppnå ett tydligt utseende.
- Behandla formen med 10 μL hydrofoberingsmedel (dvs. Repel-silan ES) och låt den vila i 7 minuter, vilket säkerställer en smidig lossning av den polymeriserade PDMS från formen senare.
- Skölj formen 1x med 70% etanol och 2x med avjoniserat (DI) vatten. Låt formen lufttorka under huven med laminärt flöde.
- Häll försiktigt PDMS-blandningen på formen tills den avsedda sluthöjden på enheten uppnås. För att förhindra att luftbubblor bildas, häll blandningen försiktigt och på nära avstånd från formens yta.
- Täck över formen och överför den i 18 minuter till en förvärmd ugn som har förvärmts och stabiliserats till 80 °C för härdning. För enhetshöjder över 5 mm och upp till 1 cm, förläng härdningstiden från 18 till 25 min.
- Under huven med laminärt flöde, lossa försiktigt det härdade PDMS-blocket från formen och sänk ner det i isopropanol i minst 10 minuter, inuti en petriskål av glas. Isopropanol eliminerar otvärbundna PDMS. Håll alltid PDMS-blocket täckt.
- Förnya isopropanolfen och skär försiktigt ut den centrala fyrkantiga delen av enheten (identifierad som målområdet i detta arbete) under ett stereomikroskop med en oftalmisk kniv. Fortsätt sedan att skära ytterligare längs kanterna för att uppnå enhetens ultimata form.
- Ta upp enheten från isopropanol och sänk ner den i etanol i 30 minuter och skölj den sedan 3 gånger med sterilt DI-vatten. Behåll steriliteten från och med nu.
- Under en huv med laminärt flöde, överför enheten till en ny petriskål och lämna locket något öppet. Låt den lufttorka helt.
- Montering av anordningar och förberedelse av cellodlingssubstrat.
- Sterilisera varje mikroelektrodmatris (MEA) genom att sänka ner den i 70 % etanol i 30 minuter och skölj den sedan 3 gånger med sterilt DI-vatten.
- Använd en steril fin pincett, under en laminär flödeshuv och stereomikroskop, montera PDMS-enheten på insidan av en MEA. Rikta in ena sidan av PDMS-enheten mot mitten av det inre MEA-området, med substratintegrerade mikroelektroder, så att få mikroelektroder lämnas otäckta från både käll- och målområden (se figur 2).
OBS: För detta arbete är det inte nödvändigt att rikta in MEA-mikroelektroder mot PDMS-enhetens mikrokanal. Ett försiktigt tryck på enheten kan krävas för att uppnå en tät tätning mellan PDMS-enheten och MEA-ytan. Undvik till varje pris att röra vid mikroelektroderna i pincettspetsen. - Sätt in MEA med PDMS-enheten på den i plasmarengöringskammaren för att aktivera ytaktiveringen genom luftplasma. Börja processen med en 4 minuters evakuering av kammaren med vakuumpump. Öppna sedan luftventilen något för att tillåta kontrollerad luftavluftning. Stäng luftventilen och slå på plasmainducerarna, justera RF-effektnivån mellan 10 W och 18 W.
- När ett glödande ljus tänds, låt processen gå i 80 s. Stäng sedan av plasmainduceraren, stäng vakuumpumpens ventil och öppna försiktigt luftventilen. Öppna kammaren för att hämta MEA.
OBS: Om plasmabehandlingen innebär att MEA exponeras för en icke-steril miljö, placera varje MEA under UV-ljus i en laminär flödeshuv i 30 minuter för att säkerställa steriliteten. - Tillsätt 1 ml polyetenimin (PEI) 0,1 viktprocent/vol till MEA och inkubera den vid 37 °C över natten. Aspirera PEI-lösningen och skölj med sterilt DI-vatten 5x. Tillsätt 1 ml av cellodlingsmediet till MEA och inkubera det före cellsådd.
3. Neuronal cellodling och elektrofysiologi
- Bered i förväg dissektionsmediet, uppslutningslösningen och lösningarna 1-3 (se tabell 1).
- Dissocierad neuronal cellodling.
- Ta försiktigt tag i nosen på en nyfödd Wistar-råttunge i åldern 0-1 dagar och utför snabb halshuggning med en vass sax.
- Dra av skalphuden, gör ett snitt längs skallens sagittala mittlinje med en fin sax och skapa sedan ett koronasnitt genom skallen vid korsningen av lillhjärnan.
- Ta bort skallen, skopa ut hjärnan med en fin spatel och överför den till ett kallt (4 °C) dissektionsmedium.
- Ta bort den subkortikala vävnaden, hippocampus och hjärnhinnorna. Finhacka vävnaden i små bitar (t.ex. 1-2 mm3) och överför dem i ett 15 ml rör. Kassera lösningen och skölj vävnaden med färskt dissektionsmedium, följt av en tvätt med digestionsmedium.
- Kassera digestionsmediet och tillsätt sedan 1 ml lösning 1. Inkubera blandningen vid 37 °C i 5 minuter. Kassera lösning 1 och skölj vävnaden med färskt dissektionsmedium. Tillsätt sedan 1 ml lösning 2 och låt blandningen stå i 10 minuter vid 4 °C.
- Kassera lösning 2 och skölj vävnaden med färskt dissektionsmedium. Tillsätt sedan 1 ml lösning 3. Dissociera cellerna mekaniskt genom att långsamt pipettera upp och ner i lösningen 20 till 30 gånger. När en jämnt grumlig blandning av dissocierade celler uppträder, höj dess volym till 3 ml genom att tillsätta dissektionsmedium.
- Samla upp cellpelleten genom att centrifugera blandningen vid 100 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml förvärmt odlingsmedium.
- Räkna celler (dvs. med en cellräkningskammare) och justera densiteten hos cellsåddlösningen därefter.
- Såd varje MEA med 1 ml såddlösning med den nominella celldensiteten 1,8 x 106 (~ 6500 celler/mm2). Inkubera de sådda MEA i en fuktig inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 . Byt ut mediet mot färskt (dvs. veckovis) odlingsmedium varannan dag.
- Extracellulär elektrofysiologi
OBS: Dissocierade neuronala cellkulturer når en fullt mogen elektrisk fenotyp efter 2-3 veckor in vitro. Följande avsnitt beskriver ett extracellulärt stimuleringsprotokoll med hjälp av en kommersiell MEA-applikationsprogramvara (Experimenter) för att elektriskt stimulera någon av de neuronala populationerna odlade i moduler, dvs Source eller Target, samtidigt som aktiviteten hos båda populationerna registreras i mogna nätverk.- Montera försiktigt en MEA inuti huvudentage på den flerkanaliga elektroniska förstärkaren, inuti en torr inkubator (37 °C, 5 % CO2) och låt den rymma i 10 minuter. Ett anpassat PDMS-lock kan tillverkas separat och användas som ett tätt lock för varje MEA, för att minska vattenavdunstning och bibehålla steriliteten.
- Starta programvaran Experimenter. Ställ in samplingsfrekvensen till 25 kHz och starta datainsamlingen genom att trycka på Starta DAQ. På panelen Datavisning visas de råa spåren av extracellulärt inspelad aktivitet för varje kanal.
- Övervaka den spontana aktiviteten och identifiera och välj visuellt 3 par närliggande mikroelektroder som är aktiva under skurar av nätverksomfattande spontana synkroniserade aktivitetsskurar, antingen från käll- eller målsidans mikroelektroder.
- I programvarans stimulatorpanel konfigurerar du parametrarna för vart och ett av de stimulerande mikroelektrodparen i bipolär konfiguration: välj en bifasisk pulsvågform och ställ in toppamplituderna till ± 800 mV och pulslängden till 200 μs.
- Ställ in inspelaren och spela in under en period av 300 ms före till 1000 ms efter stimuleringen.
- Upprepa steg 3.3.3 till 3.3.5 för käll- och målsidan på ett interfolierat sätt för det antal repetitioner som krävs.
Representative Results
Tillverkningen av en 2-kompartments polymer (neuronal) cellodlingsenhet rapporteras här, vilket exemplifierar användningen av 2PP 3D-utskrift för snabb prototypframställning av PDMS-enheter. Specifikt produceras en enhet för modulära neuronala nätverk med enkelriktad synaptisk konnektivitet och dess funktionella karakterisering presenteras i termer av extracellulär elektrofysiologi på flera platser. I korthet realiserades en form i mikrometerskala med hjälp av direkt laserskrivning med hjälp av en kommersiellt tillgänglig 3D-skrivare. I synnerhet levererar skrivaren en effekt på 50 mW genom laserpulser med mittvåglängd på 780 nm och en varaktighet på 80 till 100 fs. Under tillverkningsprocessen fokuseras laserstrålen genom skrivarens objektiv (25x, NA=0,8) på den negativa fotoresisten (IP-S) för att skanna utskriftsvolymen med hjälp av galvoskannern för x- och y-axlarna och piezosteget för z-axeln. Tryckvolymen delades lämpligt i block på 200 mm x 200 mm x 265 mm för att realisera en form med en total storlek på 6500 mm x 6500 mm x 545 mm och nominell volym på 12,423 ml. Figur 2A visar en 2D-skiss av formen, som framhäver dess dimensioner och funktioners storlek, medan figur 2B visar ett närbildsfoto av den färdiga enheten monterad på en MEA. Formarna som förbereddes enligt beskrivningen i föregående avsnitt var hållbara och kunde återanvändas mer än 50 gånger för att tillverka PDMS-enheter.
Den tryckta formen användes för att gjuta PDMS-enheten, som sedan monterades på det inre området av glassubstratintegrerade matriser av mikroelektroder (MEA), för att användas för extracellulära registreringar av neuronal elektrisk aktivitet på flera platser och som ett proof-of-principle. Kommersiella substratintegrerade MEA användes för att övervaka aktiviteten hos modulära kulturer som svar på rumsligt lokaliserade elektriska stimuli som levererades extracellulärt av en delmängd av mikroelkromod belägen i varje kulturfack. Varje MEA innehåller 120 mikroelektroder av titannitrat (TiN) med en diameter på 30 μm och 100 μm interelektrodstigning. Figur 2C-D visar placeringen av PDMS-enheten ovanpå MEA. De geometriska egenskaperna hos enskilda mikrokanaler i enheten tillsammans med kammarens totala fotavtryck som visas i figur 2C, leder till en uppdelning av de odlade neuronerna. Dessa kan särskiljas baserat på vilket fack de tillhör, i enhetens yttre område (Källa) eller i det inre området (Mål) på enheten. Den föredragna axonala styrningen, begränsad från källan till målet, dikteras av mikrokanalernas skarpt vinklade kanter. Figur 2D visar placeringen av den polymera anordningen på MEA och det relativa täckningsområdet för registreringselektroder som är placerade i käll- eller målfacken. Observera att en exakt inriktning av insidan av enhetens mikrokanaler till en eller flera rader av MEA-mikroelektroder varken krävdes för vår fallstudie eller fullföljdes.
Representativa bevis på asymmetrisk neurittillväxt ges i figur 3, under ex vivo-utveckling, som visar fluorescerande märkta neuriter vid levande avbildning, 6 dagar (figur 3A) och 2 dagar efter cellplätering (figur 3B-D). Medan neuriterna på målsidan av enheten stötte på skarpa vinkelbarriärer som hinder som hindrade deras framfart genom rymden, växte neuriterna som härrörde från källsidan oavbrutet och korsade kanalerna. Denna asymmetri gynnar en enkelriktad axonal anslutning mellan neuroner i de två facken, som projicerar från källa till mål, som uttryckligen avses från designen. Detta resultat stöds ytterligare av en (funktionell) elektrofysiologisk utvärdering av elektriska svar som framkallas av stimuli som alternativt levereras i vart och ett av de två facken.
Efter 3-4 veckor in vitro, när neuronala nätverk nådde full mognad29,30, kunde den funktionella konnektiviteten över de två avdelningarna undersökas vid leverans av korta elektriska stimuli och övervakning av de neuronala svaren de framkallade31. Bifasiska elektriska impulser med en amplitud på 800 mV applicerades sedan alternativt endast på källan eller endast på målpopulationerna (N repetitioner = 150, N modulära kulturer = 6), levererade av 3 parallella par plana mikroelektroder i en bipolär konfiguration och på ett interfolierat sätt. Därför kan de 3 elektrodparen placeras inom MEA:s källområde eller inom MEA:s målområde. De elektriska svaren som framkallades av varje stimulus kunde sedan detekteras av alla MEA-mikroelektroder efter en utbredningsfördröjning. Inspelningar utfördes med en samplingsfrekvens på 25 kHz/kanal, och de resulterande extracellulära råa elektriska signalerna digitaliserades med en analog-till-digital omvandlingsupplösning på 16 bitar. En algoritm för att detektera toppar32 användes offline för att detektera tidpunkten för förekomster av extracellulära aktionspotentialer, utan att utföra någon spiksortering. Figur 4A-B visar tydligt en stark asymmetri av framkallade responser, som upprepas 150 gånger, beroende på platsen för stimulusleveransen, vilket tyder på en betydande funktionell inverkan av de geometriska begränsningarna på den föredragna riktningen för konnektivitet. Faktum är att vid stimulering av Källans neuronala population, ökade avfyrningshastigheten för Källans neuronala population - uppskattad genom att beräkna histogrammet för peri-stimulusspikar - som förväntat och genererade en fullständig nätverksexplosion av aktionspotentialer 33,31,34 och det följdes, efter en fördröjning, av en ökning av avfyrningshastigheten hos Target-populationen. Men eftersom stimuleringen levererades inom målpopulationen ökade endast avfyrningshastigheten för målpopulationen med källpopulationen som förblev mestadels tyst. Figur 4C-D upprepar samma stimulus/responsparadigm i en kontrollkultur, utan någon polymer enhet närvarande (dvs. en ostrukturerad neuronal kultur), de extracellulära stimuli levererades också under 4 repetitioner. För sådana kontrollbetingelser förekom ingen asymmetri i de svar som framkallades av något av stimulus. Medan undergruppen av MEA-mikroelektroder som användes för att leverera stimuli matchade den som används i modulära nätverk, ledde placeringen av stimulusleveransen till en liknande framkallad respons från hela befolkningen. Detta bekräftar att PDMS-enheten gynnade enkelriktad synaptisk anslutning över de två avdelningarna. Sammantaget indikerar asymmetriska svar som framkallas i modulära kulturer (N = 6) och symmetriska svar som framkallas i kontrollkulturer (N = 4) starkt en begränsad anatomisk konnektivitet hos ett uppdelat in vitro-system. De elektrofysiologiska data och skript som används för att generera figur 4 görs tillgängliga via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
Figur 1: Skiss över tillverkningen av 2PP-mikroformar och PDMS-replikagjutningen. (A) En 3D-modell designas i CAD och exporteras i Standard Tessellation Language (STL) formatfil, (B) instruerar dess 2-fotoner 3D-utskrift genom laserinducerad polymerisation i en droppe harts (IP-S). (C) Den resulterande strukturen används som en form för upprepad tillverkning av PDMS-repliker. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på intern snabb prototypframställning av en PDMS-enhet för polymer (neuronal) cellodling. (A) På mindre än 24 timmar gör additiv tillverkning i mikroskala det möjligt att gå från en CAD-modell till en 3D-printad master, som kan användas omedelbart och upprepade gånger som en replikform med biokompatibla elastomerer, såsom PDMS. (B-C) De resulterande PDMS-enheterna är kopplade till ett neuronalt cellodlingsplant substrat, här representerat av en rad mikroelektroder. För den specifika provdesignen i (A) definieras två kammare: en som kallas källa och indikeras med S, och den andra som kallas mål och indikeras av T. (D) Neuroner som pläteras i varje kammare kan bara odla sina neuriter genom en serie mikrokanaler. När de är korrekt inriktade under stereomikroskopivägledning i (C) lämnas två uppsättningar substratintegrerade mikroelektroder exponerade, så att den bioelektriska aktiviteten hos närliggande neuroner som finns i båda facken kan stimuleras och registreras. Observera här att inriktning av mikroelektroder inom enskilda mikrokanaler inte var prioriteten för detta proof-of-principle. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Levande avbildning av cellimpermenade fluorescerande reportermolekyler, identifierar neuriter som förlängts av nervceller, några dagar efter cellplätering. (A-D) Representativa konfokala fluorescensmikroskop av modulära neuronala kulturer av enheten tillverkade från figur 1 och figur 2 (N = 4, 128 individuella mikrokanaler) har förvärvats 2 och 6 dagar efter cellplätering. (B-D) 40x förstoring och en inverterad gråskala på mikrobilderna för ökad synlighet. Ändarna på mikrokanalerna från Source- och Target-facken betecknas med S respektive T. (A) visar den breda skanningsbilden av kulturen, där källan (dvs. den inre kvadratiska arealen) och Target (dvs. den yttre arealen) är fulla av celler, 6 dagar efter plätering. (B) och (C) visar, vid den tidigare tidpunkten av 2 dagar efter plätering, tillväxten av neuriter vid källan respektive på målsidan av mikrokanalerna. De små svarta trianglarna indikerar representativa exempel på förmodade axonbuntterminaler, som uppenbarligen endast härstammar från källan. De pilformade mikrokanalernas gränser pekar på förlängningen av neuriter längs kanten (B), där deras passage är oavbruten och styrs mot målet. I motsatt riktning, och bredvid Target-änden av en mikrokanal (C), är neuriter som kommer från Target och avancerar till Source-sidan fångade i de skarpa hörnen. (D) avslöjar vidare detaljerna i neuritutväxten inuti en mikrokanal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Funktionell karakterisering av neuronala elektriska svar, med och utan PDMS-enheten. MEA användes som cellodlingssubstrat och användes för att mäta de nätverksomfattande spikningssvaren som framkallades av en mycket kort (dvs. 200 μs, 0,8V) bifasisk elektrisk stimuleringspuls, levererad i en bipolär konfiguration. Med PDMS-enheten i figur 2 skiljer sig de neuronala spikningssvaren som registreras från källan (röd) och från målet (blå) åt beroende på var stimulus levereras. Förmodade axonala, synaptiska och integrationsfördröjningar blir uppenbara i (A) men inte i (B), vilket tyder på att det finns en föredragen synaptisk anslutning (dvs. från källa till mål). (C-D) Under kontrollförhållanden (dvs. utan PDMS-enhet) beror framkallade svar som detekteras vid två distinkta uppsättningar MEA-mikroelektroder inte på stimulusleveransplatsen. Den bleka skuggningen, som omsluter linjerna i diagrammen, betecknar medelvärdets momentana standardfel (N stimuli = 150). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lösningens namn | Sammansättning | ||
| polyetenimin (PEI) 0,1 % | 1 ml PEI-stamlösning, 9 ml sterilt avjoniserat (DI) vatten. | ||
| Odlingsmedium (50 ml) | Minimum Essential Medium (MEM), kompletterat med 20 μM glukos, 50 μg/ml gentamicin, 50 μM L-glutamin och 10 % värmeinaktiverat hästserum. | ||
| Dissektionsmedium (1000 ml) | Hanks′ balanserade salter 9,52 g, natriumbikarbonat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glukos 6 g, Kynurensyra (slutlig koncentration 200 μM), D-AP5 (slutlig koncentration 25 μM), Gentamicin 250 μl, Bovint serumalbumin 300 mg, Magnesiumsulfat 1,44 g. Justera pH-värdet till 7,3, skydda mot ljus och förvara vid 4°C. | ||
| Digestion medium (100 ml) | Natriumklorid 800 mg, Kaliumklorid 37 mg, dinatriumvätefosfat 99 mg, HEPES 600 mg, Natriumbikarbonat 35 mg, Kynurensyra, 200 μL (från 100 mM stam), D-AP5 100 μL (från lager 25 mM). Justera pH-värdet till 7,4, skydda mot ljus och förvara vid 4 °C. | ||
| Lösning 1 | Trypsin 5 mg, Deoxiribonukleas I 1,5 mg, i 2 ml matsmältningsmedium. | ||
| Lösning 2 | Trypsinhämmare 5 mg, i 5 ml dissektionsmedium. | ||
| Lösning 3 | Deoxiribonukleas I 1,5 g, i 2,5 ml dissektionsmedium. | ||
Tabell 1: Tabell över lösningar. Se materialtabellen för produktbeskrivningar.
Kompletterande kodningsfil 1: STL-designfilen motsvarar strukturen som visas i figur 2A. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Trots att den är decennier gammal är tillämpningen av 2PP-teknik i PDMS-baserad replikgjutning i mikrometerskala en ny utveckling43,44. I detta sammanhang diskuteras en rad punkter nedan för att hjälpa användare att effektivt reproducera detta verk.
För 3D-modelldesign, se till att modellen inte har hål eller självskärningar. Privilegium för det binära filformatet när du sparar som STL, för dess mindre filstorlek än ASCII-kodad. Detta är särskilt fördelaktigt för konstruktioner med intrikata geometrier och för milliliterbreda objekt. Att använda binära STL-filer innebär också låg CPU-belastning, vilket senare i processen förbereder den mekaniska delen för att 3d-printas. Funktionernas fysiska dimensioner i STL-filen representeras i dimensionslösa enheter. Under efterbearbetningen av STL-filen tolkas enheter som mikrometrar. Därför rekommenderas det att i förväg använda den intressanta enheten, dvs. mikrometern, när du förbereder filen. Noggrannheten hos den tryckta modellen bestäms av antalet ytor som approximerar tessellerade trianglar. För ett otillräckligt antal ytor kommer oönskad ytjämnhet att uppstå. Att sikta på alltför hög noggrannhet med ett mycket stort antal ytor kommer dock till priset av en hög beräkningsbelastning, vilket gör att filbearbetningen blir långsam.
För 3D-utskrift, under utskrift, bildas det fysiska 3D-objektet med hjälp av snabb galvo-skanning i x-y-planet och piezorörelse i z-riktningen. Detta fokuserar femtosekundlaserstrålen i en given 3D-voxel. Men när utskriftsstrukturerna är större än galvos och piezos rumsliga täckningsområden måste objektet delas upp programmatiskt i block. Även om detta är ett krav för millimeterstora tryckta delar, är korsningar mellan block associerade med (ofullständiga) sömnadslinjer. Noggrann optimering av antalet block och placering av sammanfogningslinjer i x-, y- och z-riktningarna är avgörande för att undvika att störa kritiska geometriska egenskaper hos det slutliga objektet med sammanfogningslinjer. Bubblor kan bildas vid tryckgränssnittet av olika anledningar (t.ex. substrat, fotoresistens föroreningar och inhomogeniteter) och negativt påverka kvaliteten och integriteten hos den tryckta strukturen. Dessutom kan högre lasereffekt leda till en ökning av deras förekomst. Att minska lasereffekten, vid det lägsta lagret av den tryckta delen, kommer att minimera risken för bubbelbildning. Som ett alternativ till att skriva ut hela delen som en solid struktur kan skal- och ställningsmetoden övervägas. Det innebär att endast den yttre ytan av delen (skalet) skrivs ut samt triangulära prismaelement i den. Dessa element är separerade av horisontella lager (byggnadsställningar), som håller det opolymeriserade hartset i små fickor. Denna metod förkortar utskriftstiden avsevärt, vilket är särskilt relevant för millimeterstora strukturer. Men eftersom icke-polymeriserat harts finns kvar, är UV-exponering efter tryckning absolut nödvändig för att säkerställa full mekanisk stabilitet, även om detta steg måste utföras försiktigt för att undvika deformation av den tryckta delen. Efterhärdningstiden beror på valet av harts, delens tjocklek och UV-effekt40. För optimala resultat rekommenderas att genomföra ett första försök för att uppskatta den tid som behövs för härdning på fullt djup, med hjälp av en droppe fotoresist och utvärdera dess snittskärning efter UV-exponering. Den vanliga härdningsperioden varierar mellan 5 och 20 minuter.
För PDMS-replikgjutning kan det vara en utmaning att tillverka en PDMS-enhet med mikrometerskala, utan renrumsanläggningar: luftburna mikropartiklar kan finnas på PDMS-systemets mycket vidhäftande yta och hindra tätningen mellan enheten och substratet, eller blockera sektionen av enskilda mikrokanaler. Att utföra protokollstegen under en huv med laminärt flöde och konsekvent avskärma PDMS-ytan med isopropanol minimerar kontamineringsriskerna avsevärt. Härdningstemperaturen och dess varaktighet påverkar direkt PDMS-tvärbindningen och de resulterande fysikaliska egenskaperna. I synnerhet är vidhäftningsförmågan hos härdad PDMS en kritisk faktor. Å ena sidan krävs en tät tätning mellan PDMS-enheten och ytan som används för neuronal cellodling (t.ex. ett glasglas eller en MEA), för att effektivt begränsa passagen av neuriterna. Å andra sidan bör PDMS-enheten fästas på ytan reversibelt, så att det ömtåliga isolerande skiktet MEA inte skadas efter att enheten tagits bort. Även om PDMS-krympning under härdning sker och kan korrigeras genom att skala om formen i förväg, kommer krympningen för temperaturer och härdningsintervall som anges här att vara mindre än 2 %42 och kommer inte att påverka signifikant, enskiktiga PDMS-enheter. Sammantaget, följ exakt de rekommenderade härdningstemperatur- och varaktighetsvärdena för bästa resultat.
Översikt över metodens fördelar och begränsningar
En teknik baserad på direkt laserskrivning med 2 foton föreslås för snabb tillverkning av polymera enheter i mikroskala för experimentella studier av modulära neurala nätverk. Till skillnad från mjuk fotolitografi kräver det föreslagna tillvägagångssättet inte en hög nivå av teknisk expertis, förutsatt att en funktionell 2PP 3D-utskriftsinstallation är tillgänglig och operativ. Anmärkningsvärt nog gör metoden det möjligt att gå från en CAD-designad 3D-modell till en funktionell PDMS-enhet på en enda dag, vilket ger en direkt och effektiv väg från koncept till konkret förverkligande. Att välja utskriftsläget för skal och ställning minskar avsevärt den tid som krävs för att skapa formen, eftersom endast en bråkdel av dess volym skrivs ut. Efterföljande UV-härdning av den tryckta komponenten garanterar dess mekaniska stabilitet och robusthet, vilket verifieras här över 50 gjutningscykler med PDMS.
Jämfört med traditionella metoder har 2PP 3D-utskrift en klar fördel, som är mest uttalad när det gäller tillverkning av formar med ett betydande bildförhållande, krävande upplösningskrav och komplexa tredimensionella geometrier. Produktionen av masterformar med hjälp av standard UV-litografi begränsas av en resisttjocklek på cirka 200 μm. Intrikata sekvenser av spinnbeläggnings- och exponeringscykler35, kostsamma LIGA (litografi, galvanisering och gjutning) eller djupa reaktiva jonetsningsprocesser (DRIE)36 krävs för att uppnå större höjd- och bildförhållanden. I skarp kontrast, som demonstrerades i det banbrytande arbetet av Kumi et al. 201037, erbjuder 2PP-tekniken ett i princip obegränsat utrymme för bildförhållandet för de tryckta delarna, som sträcker sig från submikrometer till millimeter. Här har mikrotillverkningsprocessen för en form med betydande skillnad i höjd på dess delar exemplifierats, med en över 100-faldig skillnad mellan mikrokanalernas höjd (5 μm och den maximala formens höjd (545 μm; se figur 2).
Dessutom kan submikrometerupplösning lätt uppnås genom att följa de protokollspecifikationer som beskrivs. Som jämförelse kräver det kapitalinvesteringar för att uppnå förbättrade mögelupplösningar genom UV-fotolitografi. Maskerna med den finaste upplösningen, som använder kromdeposition på kvarts med en nominell upplösning på 600 nm, är prissatta flera storleksordningar högre än de lasertryckta OH-maskerna, som har en upplösning på 250 μm35, se dock arbetet av Pirlo et al.41. För att vara lönsam för internt bruk måste en vald metod vara kostnadseffektiv. För många biologiska laboratorier utgör den totala kostnaden i samband med konventionell mjuk fotolitografi eller direkt laserskrivning ett hinder. Även om det är möjligt att göra båda teknikerna mer tillgängliga genom att köpa och montera de väsentliga komponenterna, kräver detta tillvägagångssätt ytterligare expertis och kräver fortfarande en betydande investering. I detta sammanhang är en viktig punkt att tänka på det bredare spektrumet av tillämpningar som kan uppnås genom direkt laserskrivning. Till skillnad från konventionell mjuk fotolitografi, som främst är begränsad till mikrotillverkning av formar, uppvisar 2PP 3D-utskrift en anmärkningsvärd mångsidighet. Dess potentiella tillämpningar sträcker sig från mikrofluidik och mikrooptik till integrerad fotonik och mikromekanik. Detta gör det tilltalande att investera i denna teknik som en gemensam anläggning för flera och olika vetenskapliga områden. Till exempel är den 2PP-baserade metodiken som utarbetats i detta protokoll resultatet av ett tvärvetenskapligt samarbete mellan neurovetenskapliga och matematiska avdelningar inom vår institution. Dessutom är fotoresistutvecklingen ett aktivt forskningsområde och kan potentiellt utöka användningsområdet för 2PP 3D-utskrift. Ett exempel på detta är den nyligen introducerade IP-PDMS-hartsen. Genom att polymerisera till strukturer med egenskaper som PDMS38 låser detta harts upp potentialen för direkt mikrofabrikation av biokompatibla komponenter som har invecklad yta eller innehåller ihåliga utrymmen. Dessa krångligheter står som hinder för att uppnå liknande resultat genom konventionella replikgjutningsprocedurer.
Som en demonstration av denna metod tillhandahölls bevis som tyder på utvecklingen av enkelriktad konnektivitet mellan två moduler i ett modulärt neuronalt nätverk. Mikroskaleformen, tillverkad med 2PP-teknik, hade tillräckligt med uthållighet för att genomgå flera PDMS-gjutningar och har den nödvändiga precisionen i mikroskala. Sammanfattningsvis kan sägas att tillämpningsområdet för det protokoll som beskrivs i detta arbete sträcker sig längre än det fall som illustreras. I takt med att tillgången till 2PP-utskriftstekniken blir allt mer utbredd kommer den initiala investeringen som krävs för dess implementering att minska samtidigt som dess utbud av potentiella tillämpningar kommer att utökas.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
M.G. erkänner ekonomiskt stöd från Europeiska unionens ramprogram Horisont 2020 genom Europeiska innovationsrådet (IN-FET-projektet, GA n. 862882, Arbor-IO-projektet, FLAG-ERA och Human Brain Project, ID 650003) och från SISSA (Neuroscience Area). G.N. erkänner ekonomiskt stöd från det italienska ministeriet för universitet och forskning (MUR) genom bidraget Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikområdet). Vi tackar M. Gigante, B. Pastore och M. Grandolfo för deras hjälp med 3D-utskrift, cellodling och live-imaging, samt Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente och H.C. Schultheiss för diskussioner. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J.
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
- Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
