Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Evaluering af kemikaliers toksicitet ved hjælp af et Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66153
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 4, 5, 1, 1, 6, 1
1Institute of Biological and Chemical Systems - Biological Information Processing, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 2DITABIS AG - Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 4School of Biosciences, University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology, Helmholtz-Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Vi beskriver et screeningssystems arbejdsgang og dataanalyse til evaluering af kemisk sammensat toksicitet baseret på zebrafiskens embryo vibration startle response. Systemet registrerer zebrafiskembryoners bevægelser efter eksponering for en vibrationsstimulus og giver mulighed for en integreret evaluering af generel toksicitet/dødelighed og neuromuskulær toksicitet.

Abstract

Vi udviklede et simpelt screeningssystem til evaluering af neuromuskulær og generel toksicitet i zebrafiskembryoner. Det modulære system består af elektrodynamiske transducere, over hvilke vævskulturskåle med embryoner kan placeres. Flere sådanne højttaler-vævskulturskålpar kan kombineres. Vibrationsstimuli genereret af de elektrodynamiske transducere inducerer et karakteristisk forskrækkelses- og flugtrespons i embryonerne. Et bæltedrevet lineært drev placerer sekventielt et kamera over hver højttaler for at optage embryonernes bevægelse. På denne måde kan ændringer i startleresponsen på grund af dødelighed eller neuromuskulær toksicitet af kemiske forbindelser visualiseres og kvantificeres. Vi præsenterer et eksempel på arbejdsgangen for screening af kemiske forbindelser ved hjælp af dette system, herunder forberedelse af embryoner og behandlingsopløsninger, drift af registreringssystemet og dataanalyse til beregning af benchmarkkoncentrationsværdier for forbindelser, der er aktive i assayet. Den modulære samling baseret på kommercielt tilgængelige enkle komponenter gør dette system både økonomisk og fleksibelt tilpasningsdygtigt til behovene i bestemte laboratorieopsætninger og screeningsformål.

Introduction

I de senere år er zebrafisk blevet meget populære modelorganismer til evaluering af kemiske sammensatte effekter, der omfatter forskningsområder fra lægemiddeludvikling til miljøtoksikologi1. Som hvirveldyr deler zebrafisk mange aspekter af deres genetiske sammensætning og generelle fysiologi med mennesker 2,3. Derfor er resultater opnået i denne model ofte direkte relevante for menneskers sundhed. Flere lægemiddelkandidater, der i øjeblikket er i kliniske forsøg, er blevet identificeret i sammensatte skærme ved hjælp af zebrafisk4.

Toksicitetsvurdering er en vigtig anvendelse, hvor forsøg med zebrafiskens embryonale stadier er af interesse. Der findes forskellige retningslinjer for test fra Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) for anvendelse af zebrafisk i miljøtoksicitetstest 5,6. Zebrafiskembryonernes lille størrelse og hurtige udvikling gør dem særdeles velegnede til screening på en medium til høj gennemstrømningsskala 1,3,4. Toksikologiske endepunkter, som sådanne screeninger er rettet mod, omfatter embryonale misdannelser og dødelighed7, hormonforstyrrendevirkninger 8, organtoksicitet9 og adfærdsmæssige vurderinger, der indikerer neural toksicitet10,11. De adfærdsmæssige analyser er mulige, fordi zebrafiskembryoner viser forskellige typer lokomotoriske reaktioner på forskellige stimuli afhængigt af deres udviklingsstadium. For eksempel viser embryoner 1 dag efter befrugtning (dpf) spontan halespiral12 og reagerer på en sekvens af lysimpulser med en typisk sekvens af bevægelser, det såkaldte fotomotoriske respons (PMR)10. Efter udklækning, der typisk forekommer omkring 48-72 timer efter befrugtning (hpf), udvikler de frit svømmende eleutheroembryoner13 gradvist skræmmende og undslipper reaktioner på vibrationsstimuli, der starter omkring 4 dpf14. Disse reaktioner er kendetegnet ved en karakteristisk bøjning til retningen modsat stimulusretningen (den såkaldte C-bøjning eller C-start), som efterfølges af en mindre modbøjning og svømmeadfærd 14,15,16,17. Især styres embryonal adfærd af neurale kredsløb ved hjælp af forskellige neurotransmittersystemer, hvilket giver mulighed for at undersøge kemiske forbindelseseffekter rettet mod disse systemer. For eksempel afslørede PMR-analysen virkningerne af forbindelser, der interfererer med kolinerge, adrenerge og dopaminerge signalering10, mens startleresponsen involverer kolinerge, glutamaterge og glycinerge neuroner 16,18. Desuden vil forbindelser, der beskadiger musklerne eller den neuromuskulære grænseflade, også påvirke denne adfærd, ligesom forbindelser, der er giftige for hårcellerne i det indre øre / sidelinjen19,20. Observation af zebrafisk lokomotorisk adfærd som reaktion på en stimulus er således et egnet middel til at vurdere ikke kun neurotoksicitet, men lige så ototoksicitet og myotoksicitet. Scoring lokomotorisk adfærd tjener også som en proxy for generel toksicitet / dødelighed vurdering, da døde embryoner ikke bevæger sig. Derved repræsenterer embryonal bevægelsesadfærd en integreret aflæsning for en første niveau toksicitetsscreeningsmetode, hvilket indikerer dødelige og neuromuskulære sammensatte virkninger i en opsætning. Da eleutheroembryonerne allerede er i stand til at metabolisere forbindelser, kan fremgangsmåden også påvise virkningerne af metaboliske transformationsprodukter 7,21,22. Det er vigtigt, at zebrafiskembryoner ikke betragtes som beskyttede livsstadier i henhold til visse dyrebeskyttelseslovgivninger før stadiet med fri fodring efter 120 hpf13. De betragtes derfor som et alternativ til dyretoksicitetstest.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af vibrationsstartle response-system. (A) Oversigt over systemet. Plader med embryoner udsat for testforbindelserne placeres på det elektrodynamiske transducerarray ("højttalere"). Kameraet flyttes sekventielt af det bæltedrevne lineære drev til optagepositionen over den målrettede transducer. (B) Detaljeret billede af transduceren/højttaleren med vævskulturskålen indsat øverst. Pladerne belyses nedefra af et LED-lysark ved 4000-5000 lux. Et LED-lys ved siden af højttaleren lyser, mens stimulus gives. (C) Stillbillede af video optaget af kameraet efter stimulering af embryonerne. (D) Skærmbillede af konfigurationsfilen. (E) Skærmbillede af optagelsessoftwarens grænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Her beskriver vi en testprotokol til evaluering af sammensatte virkninger på vibrationsstartleresponsen ved hjælp af en intern bygget simpel testenhed baseret på vibrationsstimuli genereret af elektrodynamiske transducere kombineret med en automatiseret videooptagelse af flere frit bevægelige embryoner i en vævskulturskål23. Systemet er modulært og giver mulighed for sekventiel optagelse fra flere vævskulturretter parallelt. I den aktuelt anvendte opsætning tilvejebringer fem elektrodynamiske transducere en vibrationsstimulus (500 Hz, varighed 1 ms) til vævskulturskåle indeholdende 20 embryoner placeret oven på dem (figur 1). Pladerne belyses nedefra ved 4000-5000 lux med LED-lysplader. Et LED-lys ved siden af hver transducer angiver perioder med stimuluspåføring, og et oscilloskop angiver bølgeformer og frekvens af den påførte stimulus (for detaljer, se ref. 23). Embryonernes opførsel registreres af et højhastighedskamera (materialetabel) med 1000 billeder pr. Sekund (fps), som flyttes over den målrettede højttaler med et bæltedrevet lineært drev. Denne optagehastighed er nødvendig for pålideligt at løse startle-responsen. Systemet giver et billigt, individuelt tilpasningsdygtigt alternativ til nuværende kommercielle systemer. Den præcise arbejdsgang, der er beskrevet nedenfor, udføres i øjeblikket inden for rammerne af initiativet om præcisionstoksikologi24 for at bestemme passende eksponeringsbetingelser for indsamling af OMICS-data fra zebrafiskembryoner behandlet med et udvalgt sæt toksiske stoffer.

Protocol

Alt zebrafiskeopdræt og håndtering blev udført i overensstemmelse med de tyske dyrebeskyttelsesstandarder og godkendt af regeringen i Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Tyskland (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Fremstilling af stamopløsninger af kemikalier, der skal testes

  1. Mærk hætteglasset (eller den kemiske delprøve) med stoffets navn/forkortelse, stamkoncentration og fremstillingsdato. For eksempel CdCl2_2,5 g· L-1_210813.
  2. Centrifuger kemikaliet alikvote ved 2000 x g i 1 min ved stuetemperatur (RT).
  3. Under en damphætte vejes forbindelsen (om nødvendigt) på en skala, der er følsom over for 0,001 g, og overføres til det mærkede hætteglas. Hvis forbindelsen er en væske, tilsættes den til hætteglasset ved hjælp af en pipette og plastpipettespids.
    BEMÆRK: For eksempel blev 400 mg vejet i det mærkede hætteglas for tricainmethansulfonatstammen i resultateksemplet vist i figur 2.
  4. Tilsæt opløsningsmiddel (f.eks. sterilt rent vand eller dimethylsulfoxid (DMSO), afhængigt af forbindelsernes fysisk-kemiske egenskaber) ved hjælp af en pipette og plastpipettespids. Hvis det er muligt, er vand det foretrukne opløsningsmiddel.
    BEMÆRK: For eksempel blev der til tricainbestanden fremstillet en 15,3 mM opløsning i 100 ml vand.
  5. Forsegl hætteglasset, ryst forsigtigt, og kontroller for nedbør.
  6. Forbered (om nødvendigt) fortyndede stamopløsninger i hætteglas af glas ved hjælp af pipetter og plastpipettespidser.
    BEMÆRK: For eksempel var der ikke behov for yderligere fortynding for tricainbestanden.
  7. Stamopløsningen/stamopløsningerne opbevares ved -20 °C indtil brug.
  8. Opbevar den resterende kemiske prøve under samme betingelser som før.
  9. Registrer alikvoteoplysninger i laboratorienotesbogen.

2. Indsamling og opdræt af zebrafiskembryoner

  1. Saml embryoner i spaltningsstadier (2-8 celletrin) fra naturlig gydning af gruppeparringer i 10 cm vævskulturskåle.
  2. Vælg et parti af passende kvalitet: mindre end 10% ubefrugtede / døde æg.
  3. Rengør opvasken (fjern ufrugtede æg, snavs, skalaer osv.).
  4. 60 embryoner pr. 10 cm vævskulturskål anbringes i 15 ml E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mMCaCl2, 0,33 mM MgSO4)25.
  5. Anbring tallerkener i et befugtet kammer tilberedt ved at lægge papirhåndklæder gennemblødt med vand.
  6. Embryoner hæves indtil 72 hpf i en inkubator ved 28,5 °C.

3. Forberedelse af arbejdsfortynding af kemikalier, der skal testes

  1. Stamopløsningen tages ud af fryseren -20 °C, og den optøes.
  2. Hvis forbindelsens opløselighed er høj nok, fremstilles serielle fortyndinger i E3-medium i glasflasker, 1 ml pr. replikat pr. koncentration. Sørg for, at koncentrationen er 10 gange højere end den ønskede eksponeringskoncentration. På den måde undgår man at skulle ændre hele embryonernes medium i begyndelsen af eksponeringen. I tilfælde af lav opløselighed fremstilles de serielle fortyndinger direkte ved de ønskede eksponeringskoncentrationer, 10 ml pr. replikat pr. koncentration.
  3. Kontroller for nedbør (om nødvendigt). Hvis opløsningen er udfældet, skal du registrere dette og derefter fortyndes yderligere for at opnå den næsthøjeste koncentration. Kontroller igen for nedbør. Gentag indtil der ikke er nedbør.
  4. Kontroller eksponeringsopløsningens pH-værdi. Hvis det ligger uden for pH-området 7,0-8,5, registreres dette, og opløsningerne i E3 indeholdende 5 mM HEPES/pH 7,4 fremstilles ved justering af pH med HCl eller NaOH.
  5. Bortskaf ubrugte eksponeringsmedier i henhold til lokale regler.

4. Udsættelse af embryoner for de kemikalier, der skal testes

  1. Kontroller skålene med de 72 hpf gamle embryoner for døde/uudklækkede embryoner og fjern dem. Hvis et parti embryoner indeholder mere end 5% uudklækkede æg, fjernes batchen.
  2. Der anbringes 10 embryoner pr. 6 cm vævskulturskål i 9 ml E3-medium (eksponeringsplade).
  3. Mærk eksponeringsplader med stoffets navn, eksponeringskoncentration og replikationsnummer. For eksempel, "CdCl2 1 mg· L-1 01". Medtag om nødvendigt tilstrækkeligt mange E3-plader og en kontrolplade med opløsningsmiddel (se punkt 5).
  4. Tilsæt 1 ml eksponeringsopløsning til hver plade, start med den laveste koncentration, og hvirvl pladen rundt. For forbindelser med lav opløselighed udskiftes hele pladens 10 ml med eksponeringsopløsningen (se trin 3.2.)
  5. Optag den tidsmæssige rækkefølge, hvori sammensatte opløsninger blev tilsat embryonerne.
  6. Pladerne inkuberes i det befugtede kammer i en inkubator ved 28,5 °C i 48 timer, indtil de når 120 hpf.

5. Udførelse af vibrationsstartle-analysen

BEMÆRK: Pladerne analyseres i samme rækkefølge som registreret i trin 4.5. Hver kørsel skal indeholde en E3-kontrolplade.

  1. Tænd computeren og vibrationsenheden (blåt LED-lys skal være tændt).
  2. Forbered konfigurationsfilen i et regneark, som vist i figur 1D og vedhæftet som supplerende fil 1. Registrer eksponeringsoplysninger for hver af de 5 pladepositioner (forbindelse, koncentration, replikate).
  3. Åbn programmet for den generelle brugergrænseflade (GUI) (findes på https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit, projekt-id 43215.)
  4. Kontroller kamerabevægelsen ved at vælge de forskellige positioner i GUI-programmet og observere kamerabevægelsen.
  5. Udtag prøvepladerne, der skal måles, fra inkubatoren. Prøvepladerne anbringes på de 5 positioner (se figur 1A, "højttalere"), og embryonerne lægges til bundfældelse i flere minutter.
  6. Klik på Optag; Et vindue åbnes for at vælge konfigurationsfilen.
  7. Vælg den relevante konfigurationsfil, der blev udarbejdet i trin 5.2 til denne kørsel.
  8. Kontroller, at prøvebeskrivelsen svarer til prøverne på hver position (1-5).
  9. Måling udføres automatisk (10 s / position). Når lydpulsen påføres af programmet, tændes en LED. Registrering for 10 s / position gør det muligt at erhverve nok data til at estimere svømmehastighed og tilbagelagt afstand både før og efter stimulus påføres og forhindrer tilvænning til efterfølgende stimuli.
  10. Når optagelsen er afsluttet, går kameraet tilbage til position 1, og softwaren begynder at komprimere filerne. I løbet af denne tid skal du udskifte prøverne med det næste sæt, der skal måles.
  11. Gå til trin 5.2. for at optage den næste kørsel.
  12. Når alle plader er målt, indsamles eksponeringsopløsningerne. Brug en sigte til at fastholde embryonerne.
  13. Aflive embryonerne ved hurtig nedkøling i et is/isopropanol (5%) bad.
  14. Bortskaf eksponeringsopløsningerne og døde embryoner i henhold til de lokale regler.

6. Analyse af data

  1. Åbn videodataene med VirtualDub (1.10.4).
  2. Bedøm visuelt antallet af embryoner, der reagerer på lydpulsen (når kontrol-LED'en er tændt).
  3. Indtast data i et regneark. Forbindelsens navn, replikat, koncentrationen af forbindelsen og procentdelen af immotile embryoner registreres i henhold til skabelonen i supplerende fil 2, som omfatter eksempeldatasættet vist i figur 2C.
    BEMÆRK: Skabelonen har en fleksibel struktur og tillader principielt anvendelse af data fra andre organismer og endepunkter. Den beskriver responserne for hver koncentration og indeholder også effektparameterbeskrivelser samt definitioner af de parametre, der genereres i den efterfølgende koncentrations-respons-modellering.
  4. Udfør benchmarkkoncentrationsanalysen (BMC) ved hjælp af en KNIME-arbejdsgang (KNIME-analyse 4.626) med integrerede R-scripts (R-version 3.6., R-pakker plotrix, drc og bmd 27,28).
    BEMÆRK: I princippet kunne vurderingen også foretages direkte i R. For nemheds skyld og for at muliggøre vurdering som en webbaseret tjeneste er analysen imidlertid organiseret i en KNIME-serverkompatibel arbejdsgang. Resultatet af KNIME-arbejdsgangen findes i supplerende fil 3. Du kan finde flere oplysninger om de statistiske parametre, der genereres af KNIME-arbejdsgangen, i denne skabelon. De statistiske parametre til estimering af egnethedens godhed og tærskler til at acceptere bestemte BMC-værdier er vist i tabel 1. Selve KNIME-arbejdsgangen er tilgængelig via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Koncentrationsresponsen modelleres ved hjælp af en 4-parameter log-logistisk model. To af kurvetilpasningsparametrene kan fastsættes. Typisk ville man fastsætte maksimum til 100 i tilfælde af procentdata. Hvis der ikke observeres baggrundseffekter, kan minimumet fastsættes til 0%.

Representative Results

Figur 2A viser procentdelen af immotile embryoner i 48 koblinger af ubehandlede vildtypeembryoner (AB2O2-stamme). I gennemsnit reagerer 14,33% af ubehandlede vildtypeembryoner ikke på vibrationsstimulus. I 4 koblinger nåede procentdelen af immotile larver 50%, men 75% af koblingerne havde en procentdel af immotile larver under 20%.

Figur 2B,C viser et eksempel på en typisk beregning af en benchmarkkoncentration/dosis (BMC/BMD29,30) for sammensatte effekter på motilitet med vibrationsstartle-assay-arbejdsgangen, som i øjeblikket udføres inden for PrecisionTox-konsortiet24. BMC10-, BMC25- og BMC50-værdier svarer til de koncentrationer, hvor henholdsvis 10%, 25% og 50% af embryonerne viser immotilitetsniveauer, der er højere end baggrunden. Kun embryoner, der er fuldstændig immotile, medtages i denne beregning, ikke dem, der stadig viser delvise reaktioner, såsom kun en C-bøjning uden efterfølgende flugtsvømning eller kun halebevægelser (figur 2B). Fostrene blev udsat for 8 koncentrationer af natriumkanalhæmmeren tricain methanesulfonat, som ofte anvendes til fiskebedøvelse31. Dataene indikerer et baggrundsniveau på omkring 25% immotilitet som reaktion på vibrationsstimulus. Fra 1% tricain reduceres motiliteten og ophører derefter over 2,5%. KNIME-arbejdsgangen beregner BMC50 som 164,9 μM, hvilket svarer til 1,07% tricain og et immotilitetsniveau på 75% (figur 2C). De små 95% konfidensintervaller (angivet med de grå nuancer i kurven) indikerer robust reproducerbarhed af motilitetsværdierne i dette assay.

Figur 2D viser et eksempel på en suboptimal analysekørsel, hvis data ikke bør bruges til BMC-beregninger. Fem E3-behandlede kontrolgrupper med forskellige embryoner afledt af samme kobling er vist (AB2O2 [vildtypestamme] replikerer 1-5). Kun den første gruppe viser et næsten normalt respons, der viser omkring 25% immotilitet, der er i overensstemmelse med litteraturværdier32 og dem, der er opnået i analysen beskrevet her, som vist i figur 2A, mens alle andre grupper viser reducerede og / eller ufuldstændige adfærdsmæssige reaktioner (f.eks. Viser kun en C-bøjning ikke efterfulgt af svømmeaktivitet eller bevægelighed uden en klar C-bøjning i begyndelsen). En sådan reaktion kan forekomme, når embryoner ikke udvikler sig korrekt og er i en umoden tilstand på grund af udviklingsforsinkelse, hvilket påvirker robustheden af startle response 14,33.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på et typisk resultat, herunder beregning af benchmarkdosis. A) Procentdel embryoner, der ikke reagerer efter lydimpulsen for ubehandlede vildtypelarver i 48 koblinger (n = 10 pr. kobling). Gennemsnittet (14,33%) og standardafvigelsen (±16,19%) er angivet med rødt. (B) Evaluering af startle response-adfærd hos embryoner (n = 20 pr. Tilstand) behandlet med den angivne koncentration af tricain i E3-medium eller med E3 alene som kontrol. Adfærd klassificeres i henhold til farveskemaet og tegnefilmene angivet til højre for grafen, hvor hvert embryo kun er tildelt en af følgende klasser: "immotile": embryo viser ingen bevægelse; "halebevægelse": embryo viser halebevægelse, men hverken C-bøjning eller svømmeadfærd; "bevægelig": embryo viser svømmebevægelse, men ingen C-bøjning som reaktion på vibrationsstimuleringen; "Kun C-bøjning": embryo viser C-bøjning, men ikke undslippe svømning; "C-bøjning + bevægelig": embryo viser typisk C-bøjningsadfærd efterfulgt af flugtsvømning (den typiske fulde startle-respons). De forskellige adfærd vises som en procentdel af det samlede antal embryoner for hver behandling. (C) BMC-beregningsgraf genereret af KNIME-arbejdsgangen, der angiver procentdelen af "immotile" embryoner for hver behandlingskoncentration. Blå, røde og sorte linjer angiver BMC10-, BMC25- og BMC50-værdierne, dvs. de koncentrationer, hvor henholdsvis 10%, 25% og 50% af embryonerne viser immotilitetsniveauer, der er højere end baggrunden. (D) Eksempel på en kasseret analysekørsel. Fem E3-behandlede kontrolkørsler med forskellige AB2O2 vildtypeembryoner afledt af samme kobling er vist (replikat 1-5). Kun replikat 1 viser en næsten normal respons, mens embryoner af de resterende kørsler ikke viser den typiske C-bøjning + flugtsvømningsrespons. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Statistiske parametre til estimering af egnethedens godhed og tærskler til at acceptere bestemte BMC-værdier. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Egenskaber for et udvalg af vibrations startle response assay-systemer. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Excel-skabelon til konfigurationsfil. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: KNIME-inputskabelon med et eksempeldatasæt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Eksempel på KNIME-outputfil. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Vi præsenterer arbejdsgangen og dataanalysen til evaluering af kemiske forbindelser ved hjælp af en specialbygget zebrafisk embryo vibration startle assay opsætning. Arbejdsprocessen genererer robuste data, der gør det muligt at beregne typiske parametre, der specificerer sammensat toksicitet, såsom benchmarkkoncentration/dosis (BMC/BMD). Opsætningens modularitet muliggør tilpasning til forskellige behov for gennemstrømning og pladskrav. Da systemet er lavet af billige basale komponenter, efter en relativt enkel opsætning, giver det et billigt alternativ til eksisterende kommercielle systemer, som generelt er designet til flere analysetyper på én gang, er afhængige af proprietær software og forbliver relativt dyre.

Både disse kommercielle systemer og andre skræddersyede systemer giver mulighed for vurdering af enkelte embryoner eller larver i multibrøndplader (f.eks. 12-brønd34, 16-brønd32,35, 24-brønd 20,33,36, 48-brønd 37, 96-brønd 38,39,40,41,42 og endda 384-brønd [som 4x96 brønd]43), men den rumlige begrænsning i brøndene gør analysen af nogle dataparametre for flugtresponsen (f.eks. tilbagelagt afstand) mere udfordrende. Desuden er billeddannelse i nogle af disse opsætninger begrænset til en delmængde af pladens brønde, hvilket reducerer gennemstrømningen36,39. Billeddannelse af embryoner i skåle giver mulighed for bedre vurdering af escape response-parametre og gør det muligt at registrere flere embryoners adfærd på én gang (f.eks. op til 30 i en 6 cm skål). Normalt er skålbaseret billeddannelse begrænset til en skål pr. Kørsel 44,45,46,47,48 (undtagelser udfører billeddannelse parallelt på 6 retter med en larve hver 49 eller på 4 larver i 2 splitskåle50), en ulempe, der kan løses ved parallelle designs som i vores tilfælde. Vi har opsummeret nogle karakteristika ved det system, der anvendes i denne undersøgelse, og andre kommercielle og skræddersyede løsninger i tabel 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.

En fordel ved metoden er en aflæsning, der fanger både dødelighed og adfærdsændringer, hvilket kan øge udførelsen af toksicitetsvurderinger. For eksempel, mens zebrafiskfiskens embryo akutte toksicitetstest (FET)5 har vist sig at forudsige toksicitet i den akutte toksicitetstest for voksne fisk53 ganske godt, blev dens forudsigelsesnøjagtighed forbedret ved at inkludere adfærdsaflæsninger54. Årsagen til dette er den svage dødelighed forårsaget af neuroaktive forbindelser, der ses i fiskeembryoner, sandsynligvis på grund af manglen på respirationssvigtsyndrom, der forårsager øget toksicitet hos unge eller voksne fisk. Neuroaktivitet kan dog identificeres ved vurdering af adfærd. Desuden kan adfærdsmæssige aflæsninger også fange myotoksiske og ototoksiske virkninger såvel som andre, mere subtile toksiske virkninger på fysiologi, som er subletale og alligevel påvirker organismens adfærdsmæssige ydeevne.

Ved udførelse af analysen er det afgørende at sikre korrekt håndtering af forbindelser samt anvendelse af et homogent udviklende parti zebrafiskembryoner. Anvendelse af hætteglas af glas til opbevaring af forbindelser bør således minimere faldet i koncentrationer af kemikalier, især hydrofobe forbindelser, på grund af absorbans over for plastmateriale. I tilfælde af forbindelser med højt absorptionspotentiale til "plastisk" polystyren kan glasplader også anvendes til inkubation. Rensning af æggene i vævskulturskålene, der anvendes til indsamling og fjernelse af døde embryoner, er et kritisk skridt for at sikre standardudvikling. Normal udviklingshastighed er vigtig, da udviklingsforsinkelser kan påvirke modenheden af neurale netværk, der ligger til grund for den vurderede adfærd14,33. For at muliggøre sammenligning af sammensatte virkninger bør æg også stamme fra den samme stamme, da forskellige stammer er rapporteret at præsentere forskellige adfærdsprofiler 38,55,56,57. Under eksponeringen er det vigtigt at inkubere embryonerne i et befugtet kammer for at undgå overdreven fordampning af E3-mediet, hvilket ville ændre de testede koncentrationer.

E3-kontroller bør indarbejdes i hver serie for at bestemme basisresponsniveauet for den pågældende batch af embryoner, der anvendes i testserien. Typisk kører vi en plade med kontroller langs hvert sæt af 5 målinger. Som illustreret i figur 2D giver denne tilgang også mulighed for påvisning af batcher med suboptimale responser på grund af forsinket udvikling eller af andre årsager, såsom genetiske baggrundseffekter. I tilfælde af en uventet mangel på reaktion på stimulus skal du også passe på potentiel transducerfejl. Typisk viser startle-svarene en sigmoidal koncentrationsresponsadfærd, der muliggør kurvetilpasning ved hjælp af en log-logistisk model. I sjældne tilfælde med bifasiske reaktioner kan det dog være nødvendigt at anvende andre modeller, såsom Gaussiske eller Cedergreen-modeller. De er tilgængelige i R-pakkerne drc og bdm 27,28.

Manglen på respons på vibrationsstimulus kan simpelthen indikere embryonernes død eller alvorligt forringede livsfunktioner på grund af generel cytotoksicitet, men kan også afspejle mere specifik toksicitet rettet mod neurale kredsløb af stimulusopfattelse, integration og lokomotorisk output. Andre mulige sammensatte virkninger er interferens med den neuromuskulære grænseflade eller med muskelstruktur og funktion. For at skelne mellem disse muligheder er yderligere analyser nødvendige. For eksempel kan musklernes strukturelle integritet vurderes med et birefringensassay58,59, og transgene linjer er tilgængelige for at vurdere forstyrrelse af muskulær og neural funktion60,61. Imidlertid giver de optagede videodata allerede mulighed for en mere detaljeret analyse af embryonernes morfologi og adfærdsmæssige respons, der kan give de første yderligere oplysninger. Er kun C-bøjningen svækket eller al bevægelighed? Er der stadig rester af neuromuskulær aktivitet til stede, som indikeret af svage eller skælvende halebevægelser? Går sådanne ændrede adfærd sammen med ændringer i morfologi, såsom ødem eller øget kropskrumning? Derudover kan parametre som latenstid indtil C-bøjningen eller den tilbagelagte afstand under flugtresponsen evalueres (se f.eks. ref. 44).

Den screeningsprotokol, der er beskrevet her, giver mulighed for hurtige og robuste evalueringer af sammensat toksicitet med den merværdi, at den specifikt påviser ikke-dødelige neurotoksiske, ototoksiske og myotoksiske forbindelser. Den leverede analysearbejdsgang er nem at implementere og giver en robust udlæsning. Ændringer af stimulusprotokollerne, der anvendes i vibrationsstartle-assayet, er også blevet brugt til at adressere sammensatte virkninger på mere komplekse aspekter af startleadfærd, såsom præpulshæmning (PPI)39,44 og tilvænning32,33, og kunne tilpasses den elektrodynamiske transducerbaserede stimulusopsætning, der blev brugt i denne undersøgelse.

En hovedanvendelse af startle-response-baserede screeningssystemer er vurderingen af sammensatte virkninger i kemiske screeninger, hvilket er relevant både for human toksicitetsevaluering og lægemiddeludvikling 1,4,62. Ved at teste en akvatisk organismes tidlige livsstadier har de opnåede resultater samtidig direkte relevans for økotoksikologisk risikovurdering63,64. Derudover kan startle response-systemer bruges til adfærdsmæssig fænotypning i genetiske skærme 65,66,67,68,69. Vores let implementerbare og tilpasningsdygtige system giver en overkommelig opsætning til mindre laboratorier, der har til hensigt at gennemføre deres egne specifikke screeningsprojekter inden for disse forskellige anvendelsesområder.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender heldigvis den fremragende tekniske assistance fra supportpersonalet på IBCS-BIP fiskefacilitet og screeningscenter. Dette arbejde har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 965406 (PrecisionTox). Denne produktion afspejler kun forfatternes synspunkt, og Den Europæiske Union kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay - Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing, Paris. (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , Karlsruhe Institute of Technology. https://publikationen.bibliothek.kit.edu/1000085054 (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish - A Practical Approach. , Oxford University Press, Oxford. (2002).
  26. Preisach, C. hristine, Burkhardt, H. ans, Schmidt-Thieme, L. ars, Decker, R. einhold Data Analysis, Machine Learning and Applications. , Springer Berlin, Heidelberg. (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 203
Evaluering af kemikaliers toksicitet ved hjælp af et Zebrafish Vibration Startle Response Screening System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von… More

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter