Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen
Summary
Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.
Abstract
Die Einzelzellsequenzierung hat die Kartierung heterogener Zellpopulationen im Stroma hämatopoetischer Organe ermöglicht. Diese Methoden bieten eine Linse, durch die bisher ungelöste Heterogenität im stationären Zustand sowie Veränderungen in der Zelltyprepräsentation, die durch extrinsische Belastungen oder während des Alterns induziert werden, untersucht werden können. Im Folgenden stellen wir schrittweise Protokolle für die Isolierung hochwertiger stromaler Zellpopulationen aus murinem und humanem Thymus sowie aus murinem Knochen und Knochenmark vor. Zellen, die durch diese Protokolle isoliert werden, eignen sich für die Generierung hochwertiger Einzelzell-Multiomics-Datensätze. Die Auswirkungen des Probenverdaus, der Depletion der hämatopoetischen Abstammungslinie, der FACS-Analyse/-Sortierung und wie diese Faktoren die Kompatibilität mit der Einzelzellsequenzierung beeinflussen, werden hier diskutiert. Anhand von Beispielen von FACS-Profilen, die eine erfolgreiche und ineffiziente Dissoziation und nachgeschaltete Stromazellausbeuten in der Postsequenzierungsanalyse anzeigen, werden erkennbare Hinweise für die Benutzer bereitgestellt. Die Berücksichtigung der spezifischen Anforderungen von Stromazellen ist entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, die das Wissen auf diesem Gebiet voranbringen können.
Introduction
Beim gesunden Erwachsenen findet die De-novo-Produktion von Blutzellen im Knochenmark und im Thymus statt. Stromazellen an diesen Stellen sind für die Aufrechterhaltung der Hämatopoese unerlässlich, aber das Stroma macht weniger als 1 % des Gewebes aus 1,2,3,4. Die Gewinnung reiner Hämatopoese-Isolate, die das Stroma unterstützen, stellt daher eine große Herausforderung dar, insbesondere für die Einzelzell-Multiomik, die eine zweckmäßige Verarbeitung erfordert, um Proben von hoher Qualität zu erhalten. Komponenten verschiedener Verdauungscocktails können bestimmte Schritte in der Multiomics-Analyse beeinträchtigen 5,6. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben die Isolierung einer Vielzahl von Stromazellen aus Knochenmark- und Thymusgewebe.
Störungen der stromalen Bestandteile sowohl im Knochenmark als auch im Thymus führen zu einer tiefgreifenden Störung der Entwicklung der Blutzellen und können zu Malignomen führen 7,8,9. Die Hämatopoese, die das Stroma unterstützt, wird nach zytotoxischer Konditionierung und Knochenmarktransplantation geschädigt, was zu einer verminderten Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren führt, die hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) erhalten2,10,11. Darüber hinaus wirkt sich das Altern auf Knochenmark- und Thymusstromazellen aus, die wahrscheinlich zu gealterten hämatopoetischen Phänotypen beitragen. Der Thymus ist das erste Organ, das einer großflächigen altersbedingten Involution unterzogen wird. Fett und fibrotisches Gewebe beginnen bereits zu Beginn der Pubertät mit dem Ersatz des T-Zell-unterstützenden Stromas12,13. Im Knochenmark nimmt der Adipozytengehalt mit dem Alter zu und die vaskulären und endostalen Nischen werden signifikant umgebaut 14,15,16.
Um die Untersuchung des hämatopoese-unterstützenden Stromas über mehrere Stresszustände hinweg und im Falle des Thymus sowohl des menschlichen als auch des murinen Gewebes zu ermöglichen, haben wir die zuvor veröffentlichten Verdauungsprotokolleoptimiert 1,2,8,17,18. Diese Protokolle gewährleisten eine effiziente und reproduzierbare Isolierung von Zellen und sind mit der Einzelzell-RNAssequenzierung (scRNAseq) und anderen Arten von Multiomics kompatibel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stromazellen in hämatopoetischen Organen sind entscheidend für die normale Blutproduktion, und hämatopoetische Stromastörungen können zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen der hämatopoetischen Aufrechterhaltung und der Reaktion auf Stress führen 9,23,24. Der Einblick in hämatopoetische Stromazellen ist essentiell für das Verständnis hämatologischer Erkrankungen 7,9,10,24 und für di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wurden von der HSCI-CRM-Einrichtung für Durchflusszytometrie am Massachusetts General Hospital und der Bauer Core Facility an der Harvard University mit fachkundiger technischer Unterstützung unterstützt. T.K und K.G wurden vom Schwedischen Forschungsrat und C.M. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir danken Sergey Isaev und I-Hsiu Lee für die Unterstützung bei der Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
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