Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos
Summary
Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.
Abstract
O sequenciamento de célula única permitiu o mapeamento de populações de células heterogêneas no estroma de órgãos hematopoiéticos. Essas metodologias fornecem uma lente através da qual estudar a heterogeneidade anteriormente não resolvida no estado estacionário, bem como as mudanças na representação do tipo de célula induzidas por estresses extrínsecos ou durante o envelhecimento. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para o isolamento de populações de células estromais de alta qualidade do timo murino e humano, bem como do osso murino e da medula óssea. As células isoladas por meio desses protocolos são adequadas para gerar conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade. Os impactos da digestão da amostra, depleção da linhagem hematopoiética, análise/classificação FACS e como esses fatores influenciam a compatibilidade com o sequenciamento de célula única são discutidos aqui. Com exemplos de perfis FACS indicando dissociação bem-sucedida e ineficiente e rendimentos de células estromais a jusante na análise pós-sequenciamento, são fornecidos indicadores reconhecíveis para os usuários. Considerar os requisitos específicos das células estromais é crucial para a aquisição de resultados reprodutíveis e de alta qualidade que possam avançar o conhecimento na área.
Introduction
No adulto saudável, a produção de novo de células sanguíneas ocorre na medula óssea e no timo. As células estromais nesses locais são essenciais para a manutenção da hematopoiese, mas o estroma constitui menos de 1% do tecido 1,2,3,4. A obtenção de isolados puros de hematopoiese que suportam o estroma, portanto, constitui um desafio significativo, particularmente para multiômica de célula única que requer processamento rápido para obter amostras de alta qualidade. Componentes de diferentes coquetéis de digestão podem interferir em certas etapas da análise multiômica 5,6. Os protocolos aqui apresentados detalham o isolamento de uma ampla variedade de células estromais da medula óssea e tecidos tímicos.
Perturbações dos constituintes estromais na medula óssea e no timo resultam em profunda interrupção no desenvolvimento das células sanguíneas e podem resultar em malignidades 7,8,9. A hematopoiese que suporta o estroma é prejudicada após o condicionamento citotóxico e o transplante de medula óssea, resultando em redução da secreção de citocinas e fatores de crescimento que sustentam as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs)2,10,11. Além disso, o envelhecimento afeta a medula óssea e as células estromais do timo, provavelmente contribuindo para o envelhecimento dos fenótipos hematopoiéticos. O timo é o primeiro órgão a sofrer extensa involução associada à idade. A gordura e o tecido fibrótico começam a substituir o estroma de suporte das células T já no início da puberdade12,13. Na medula óssea, o conteúdo de adipócitos aumenta com a idade e os nichos vascular e endosteal são significativamente remodelados 14,15,16.
Para permitir o estudo do estroma de suporte da hematopoiese em vários estados de estresse e no caso do timo de tecido humano e murino, otimizamos os protocolos de digestão publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Esses protocolos garantem o isolamento eficiente e reprodutível das células e são compatíveis com o sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e outros tipos de multiômica.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células estromais em órgãos hematopoiéticos são críticas para a produção normal de sangue e as perturbações do estroma hematopoiético podem resultar em graves prejuízos na manutenção hematopoiética e na resposta ao estresse 9,23,24. O conhecimento das células estromais hematopoiéticas é essencial para a compreensão das doenças hematológicas 7,9,10,24 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fomos apoiados com assistência técnica especializada pela instalação de citometria de fluxo HSCI-CRM no Massachusetts General Hospital e no Bauer Core Facility na Universidade de Harvard. T.K e K.G foram apoiados pelo Conselho de Pesquisa Sueco e C.M. pela Fundação Alemã de Pesquisa. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee pela assistência na análise dos dados de sequenciamento de RNA de célula única.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
