Summary
Dit protocol beschrijft hoe menselijke alvleesklierplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd om de celfunctie onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze innovatieve aanpak maakt het mogelijk om normale en structureel beschadigde eilandjes te onderzoeken en de ingewikkelde wisselwerking tussen endocriene en exocriene compartimenten.
Abstract
Het is van cruciaal belang om de menselijke alvleesklier te bestuderen om de pathofysiologische mechanismen te begrijpen die verband houden met diabetes type 1 (T1D) en 2 (T2D), evenals de endocriene en exocriene fysiologie en wisselwerking van de alvleesklier. Er is veel geleerd van de studie van geïsoleerde pancreaseilandjes, maar dit verhindert het onderzoeken van hun functie en interacties in de context van het hele weefsel. Plakjes alvleesklier bieden een unieke kans om de fysiologie van normale, ontstoken en structureel beschadigde eilandjes in hun oorspronkelijke omgeving te verkennen, waardoor de interacties tussen endocriene en exocriene compartimenten kunnen worden bestudeerd om de complexe dynamiek van pancreasweefsel beter te onderzoeken. De adoptie van het platform voor levende alvleesklierplakken vertegenwoordigt dus een aanzienlijke vooruitgang in het veld. Dit protocol beschrijft hoe levende weefselplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd door weefselinbedding in agarose- en vibratome-slicing, evenals hun gebruik om functionele uitlezingen zoals dynamische secretie en beeldvorming van levende cellen te beoordelen.
Introduction
Studies over de fysiologie van eilandjes zijn van fundamenteel belang voor het begrijpen van de pathogenese van diabetes en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Tot nu toe is het onderzoek gebaseerd op geïsoleerde eilandjes, die de eilandjes blootstellen aan mechanische en enzymatische spanningen, wat waarschijnlijk veranderingen in de celfysiologie veroorzaakt; Bovendien is het niet mogelijk om de functie van eilandjes te evalueren in de context van hun natuurlijke weefselomgeving, die waarschijnlijk wordt beïnvloed door onder andere exocriene en vasculaire cellen. Bij het bestuderen van alvleesklieren van donoren met T1D is er de uitdaging dat hun eilandjes moeilijk te isoleren zijn en tijdens de isolatie gefragmenteerd kunnen raken, wat een selectie-effect kan hebben op eilandjes die mogelijk niet de populatie in vivo2 vertegenwoordigen. Bovendien zullen eilandjes worden gescheiden van hun complexe omgeving en cellulaire verbindingen, vooral van de infiltrerende immuuncellen die worden aangetroffen in ontstoken eilandjes en overvloediger zijn in de periferie van eilandjes. Hoewel geïsoleerde eilandjes dus een hoeksteen zijn van diabetesonderzoek, zijn er beperkingen. Als reactie hierop introduceren we een baanbrekend protocol voor het genereren van levende alvleesklierschijfjes, die een oplossing bieden voor deze uitdagingen.
De recente ontwikkeling en toepassing van technieken voor het snijden van pancreasweefsel wordt beschouwd als een doorbraak voor ons vermogen om de ingewikkelde biologie en functies van de alvleesklier te verkennen. Deze innovatie heeft nieuwe wegen geopend voor dynamische studies van de fysiologie van eilandjes en interacties tussen endocriene, exocriene, neurale, vasculaire en immuuncellen binnen hun natuurlijke anatomische context. In tegenstelling tot conventionele benaderingen, behoudt deze in vitro-setting een groot deel van de cytoarchitectuur van het orgaan, waardoor een nauwere benadering van de oorspronkelijke biologie mogelijk is. Oorspronkelijk ontwikkeld bij muizen door Speier en Rupnik in 20033, heeft deze methode zijn nut bewezen om calciumbeeldvorming, elektrofysiologie en hormoonsecretie te beoordelen voor zowel intra- als intercellulaire signalering 4,5,6,7,8,9. Het pancreas slice-platform werd vervolgens toegepast op de studie van menselijk pancreasweefsel verkregen via chirurgische biopsie 4,10,11,12. Onze groep toonde de haalbaarheid aan van het verkrijgen en gebruiken van plakjes alvleesklier van kadaverorgaandonoren door de activiteit van het Netwerk voor pancreasorgaandonoren met diabetes (nPOD)13. nPOD levert pancreasweefsels aan goedgekeurde onderzoekers die onderzoek doen naar diabetes type 1 bij de mens, en sinds de invoering van het pancreas slice-platform genereert en distribueert nPOD routinematig levende pancreasplakjes 14,15,16,17. Sinds de implementatie van het pancreas slice platform in 2020 heeft nPOD met succes weefselplakjes van 43 donoren (waaronder 12 donoren met T1D) gedistribueerd naar tal van onderzoekers. Met behulp van deze plakjes deden onderzoekers baanbrekend onderzoek naar kritieke aspecten van de eilandjesfunctie en verkenden ze de wisselwerking tussen eilandjes en het vaatstelsel, het zenuwstelsel en de immuuncellen in de context van T1D 13,18,19,20,21,22,23,24. Talrijke studies hebben de beperkingen van traditionele benaderingen aan het licht gebracht en het belang onderstreept van technieken die het dynamische samenspel in de alvleesklier kunnen vastleggen 25,26,27. Het aanpassingsvermogen van snijtechnieken van muis tot menselijke alvleesklier, in combinatie met hun integratie in programma's zoals het Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), is een voorbeeld van de groeiende erkenning van het potentieel van de methode om waardevolle inzichten in ziekten zoals diabetes type 1 te ontsluiten.
Protocol
Menselijke pancreassecties van weefseldonoren van beide geslachten werden verkregen via de weefselbank Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), Universiteit van Florida. Orgaanweefsel van overleden personen zonder identificatiegegevens is vastgesteld als onderzoek naar niet-menselijke proefpersonen in overeenstemming met de wet- en regelgeving inzake orgaandonatie en geclassificeerd als niet-menselijke proefpersonen door de Institutional Review Board (IRB; IRB nr. 392-2008), waarbij wordt afgezien van de noodzaak van toestemming. nPOD-weefsels die specifiek voor dit project werden gebruikt, werden door de IRB (IRB20140093) van de Universiteit van Florida goedgekeurd als niet-humaan.
OPMERKING: Voor lezers die helemaal nieuw zijn in de plaktechniek en de toepassingen ervan, zoals perifusie en calciumbeeldvorming, kan het raadzaam zijn om praktijkervaring op te doen en basisvaardigheden te ontwikkelen met behulp van muis- of rattenschijfjes 3,28 voordat ze met menselijke monsters werken.
1. Voorbereidingen
OPMERKING: Deze voorbereidingen moeten worden uitgevoerd voordat het weefsel aankomt.
- Bereid HEPES-buffer voor door 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, 2 mM L-alanine, L-arginine en L-glutamine te mengen. Pas de pH aan tot 7.4 en steriliseer het filter.
- Voeg glucose en/of andere prikkels toe aan de buffer om oplossingen voor te bereiden voor het perifusie-experiment. Voeg voor de basislijnbuffer 5,5 mM glucose toe. Deze buffer zal worden gebruikt voor snijprocedures, het verzamelen van plakjes en perifusievoorbereidingen.
- Bereid ten minste twee gerechten voor op het verzamelen van plakjes door aprotinine (10 μg/ml) toe te voegen aan de basisbuffer.
- Bereid agaroseoplossing met een laag smeltpunt in HEPES-buffer zonder BSA en aminozuren (125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES) en houd deze op 37 °C.
- Monteer de vibratoom door een nieuw mes in de houder te plaatsen. Stel indien van toepassing de hoek van het mes in op 15° (bij gebruik van Leica VT1200S). Kalibreer, indien van toepassing, het vibratoom.
- Schakel de perifusiemachine in, selecteer het aantal kamers en programmeer het protocol.
- Plaats alle benodigde oplossingen in de perifusiemachine, vul het systeem voor en houd de oplossingen verwarmd. De machine berekent wel de benodigde volumes van elke oplossing die voor het protocol wordt gebruikt.
2. Verwerking van weefsel
OPMERKING: Plakjes moeten onmiddellijk na ontvangst worden gegenereerd. Elke vertraging kan problemen in de procedure veroorzaken en leiden tot weefseldegradatie.
- Plaats pancreasweefsel in een schaal met basislijnbuffer onder een stereomicroscoop (Figuur 1A). Verwijder bindweefsel, fibrotisch en vetweefsel voorzichtig met een pincet en een schaar.
- Knip weefsel in meerdere kleine stukjes van ongeveer 0,5cm3 (figuur 1B) met een schaar of een scalpel. Dep droge stukjes alvleesklier op tissuepapier.
- Doe 4 stukken in een petrischaal van 35 mm en vul de schaal met agarose-oplossing tot alle stukjes volledig zijn ondergedompeld. Laat agarose volledig stollen.
- Snijd voorzichtig stukjes uit de agarose. Ga met de scalpel langs de rand van de schaal om de agarose te verwijderen en scheid voorzichtig de weefselblokjes. Zorg ervoor dat de stukken omgeven zijn door een dunne laag agarose.
3. Snijden
- Lijm stukjes weefsel op de metalen plaat van de vibratoom door ze ondersteboven te plaatsen.
- Monteer de plaat in de bak en vul de bak met baselinebuffer (HEPES met 5.5 mM baselineglucose).
- Stel vibratome in op geautomatiseerd snijden op 120 μm en pas de start- en eindpositie aan.
- Beweeg het mes kort boven het weefsel en begin te snijden met lage snelheid (0.1 mm/s) en amplitude op 0.8 mm. De snelheid kan worden verhoogd als het weefsel dit toelaat (Figuur 1C).
- Verzamel plakjes met een gebogen pincet of een kleine borstel. Verzamel plakjes in de basislijnbuffer die aprotinine bevatten (Figuur 1D).
- Laat de plakjes minstens 1 uur rusten in de basislijnbuffer met aprotinine. Leg de plakjes op een langzame orbitale schudder om de enzymen die door de snijprocedure zijn vrijgekomen weg te spoelen.
4. Levende/dode test
OPMERKING: Dit is een optionele test die de levensvatbaarheid van weefselplakjes na de procedure aantoont. Plakjes kunnen echter niet opnieuw worden gebruikt als ze eenmaal zijn gekleurd.
- Breng een enkel plakje over in een put gevuld met basisbuffer.
- Voeg fluoresceïnediacetaat (FDA, 50 μg/ml) toe, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht.
- Voeg propidiumjodide (PI,50 μg/ml) toe, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht.
- Breng de plak over naar een andere put gevuld met PBS om 1 minuut te wassen.
- Breng de plakjes over in een petrischaaltje of monteer ze op een glasplaatje met afdekglaasje voor beeldvorming (Figuur 2A,B).
5. Perifusie
OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe dynamische perifusie voor weefselplakjes moet worden uitgevoerd, maar het is ook geschikt voor geïsoleerde eilandjes. Eilandjeskamers moeten worden voorbereid met filterpapier en pareloplossing voordat de eilandjes worden geladen, zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de machine. Het eilandje en de plakkamer kunnen echter samen in hetzelfde experiment worden gebruikt.
- Kies 3 plakjes en snijd de agarose onder een stereomicroscoop met kwast en scalpel tot een minimum beperkt.
- Voeg een druppel baselinebuffer (HEPES met 5,5 mM baselineglucose) toe aan het rooster van de plakkamer en leg voorzichtig een plakje op het rooster. Herhaal dit voor elk van de 3 plakjes (Figuur 3A). Als de plakjes erg klein zijn, stapel dan 3 kamers om het aantal eilandjes te verhogen. Plaats niet meer dan één plak per kamer.
OPMERKING: Het aantal eilandjes per plak varieert sterk tussen donoren en is afhankelijk van de plakgrootte (10-100 eilandjes/plak). In totaal zijn 3 plakjes voldoende gebleken om zowel de insuline- als de glucagonsecretie te meten. - Gebruik voor geïsoleerde eilandjes minimaal 30 eilandjes per kolom voor insulinesecretie. Aanbevolen om 100 eilandjes te gebruiken voor glucagondetectie. Monteer de afzonderlijke onderdelen van de plakkamer van boven naar beneden.
- Sluit de slicekamer aan op de in- en uitstroomslangen in de machine en start het protocol (Figuur 3C).
- Gebruik tijdens het protocol kamerverwarming en traykoelpomp. Vervang de opvangplaten tijdens het protocol en bewaar ze bij 4 °C als de kwantificering dezelfde dag wordt uitgevoerd, of bewaar ze tot die tijd bij -80 °C.
- Wanneer het protocol is voltooid, verwijdert u de kamers, demonteert u en verzamelt u plakjes voor lysis (3% HCl in absolute ethanol) of fixatie (in 4% paraformaldehyde).
- Reinig de machine door deze door te spoelen met water, 10% bleekmiddel, water en lucht.
- Kwantificeer de hormoonsecretie met behulp van in de handel verkrijgbare detectiekits.
OPMERKING: Figuur 4 toont de absolute niveaus van insuline- en glucagonsecretie van 3 plakjes om het concentratiebereik te schatten.
6. Calcium beeldvorming
- Bereid de oplossing van calciumkleurstof (bijv. Fluo4-AM, Calbryte) voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdun de kleurstof in de baseline HEPES-bufferoplossing en voeg aprotinine (10 μg/ml) toe.
- Breng een enkele plak over en incubeer gedurende 30-60 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht.
- Bereid tijdens de incubatietijd de opstelling van de plakbeeldvorming voor door de perifusiespuiten te vullen en de slangen voor te bereiden (Figuur 5A,B).
- Sluit alle apparaten aan, schakel de verwarming in en start de pompstroom. Aanbevolen voor het gebruik van zowel instroomverwarming als platformverwarming en een debiet van 0,5 ml/min.
- Plaats voorzichtig een enkel plakje in de beeldvormingskamer en zet het vast met een harp.
- Gebruik een objectief met een lage vergroting om het beeldgebied te identificeren. Het gebruik van reflectie helpt om het eilandjesgebied te identificeren (Figuur 5C).
- Schakel over naar een objectief met een hogere vergroting (bijv. 20x of 40x) en pas de positie aan volgens de experimentele opstelling.
OPMERKING: Om een optimale levensvatbaarheid van de cellen en de integriteit van het eilandje te garanderen, wordt aanbevolen dat de optische secties zich 1-2 cellagen onder het snijoppervlak bevinden. - Stel de z-stack en/of tegelscanpositie in. Stel het beeldvormingsinterval en de opnameduur in. Hier werd een resolutie van ten minste 256 x 256 gebruikt om discriminatie van individuele cellen mogelijk te maken, een beeldvormingsinterval van 5-10 s en een z-stackbereik (indien van toepassing) van 30-60 μm met een interval van 10 μm tussen vlakken (één cellaag). Zie afbeelding 6 voor gedetailleerde beeldvormingsinstellingen.
OPMERKING: Stel de beeldvormingsparameter in om de beste resolutie en het maximale gebied te krijgen, maar vermijd het bleken van het monster. - Begin met beeldvorming en verander de instroom van de oplossing volgens het experiment. Als je klaar bent, verzamel je plakjes en repareer je ze voor immunohistochemie.
Representative Results
Wanneer het protocol met succes wordt uitgevoerd, levert 1 g alvleesklierweefsel ongeveer 100-200 plakjes op. Vervolgens moeten deze plakjes een stereomicroscoopinspectie ondergaan om de eilandjes te identificeren die rijk zijn aan eilandjes voordat wordt overgegaan tot functionele beoordelingen. De levensvatbaarheid, bepaald door etikettering met fluoresceïnediacetaat (FDA) en propidiumjodide (PI), zal naar verwachting 80%-90% bereiken (figuur 2A). De levensvatbaarheid kan aanzienlijk lager zijn aan het snijvlak als gevolg van celbeschadiging tijdens het snijproces. In levensvatbare plakjes wordt dynamische hormoonsecretie (figuur 2B) waargenomen, wat resulteert in een robuuste insulineafgifte bij blootstelling aan hoge glucose en membraandepolarisatie met kaliumchloride (KCl).
Omgekeerd, wanneer er vertragingen optreden tijdens de snijprocedure of de weefselkwaliteit suboptimaal is, verschillen de resultaten aanzienlijk. Het aantal verkregen plakjes kan afnemen en de levensvatbaarheidsbeoordeling kan wijzen op een groter aandeel niet-levensvatbare cellen met het label PI (Figuur 2C). In deze gevallen duidt de functionele beoordeling op een verminderde of zelfs afwezige respons op hoge glucose en membraandepolarisatie (Figuur 2D). De gegevens van suboptimale experimenten illustreren het belang van nauwkeurige tijdige uitvoering en weefselkwaliteit, omdat ze kunnen leiden tot verminderde levensvatbaarheid van het weefsel en verminderde functionaliteit. Deze negatieve resultaten dienen als een waardevolle herinnering aan de kritieke factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het succes van deze methode.
Veel voorkomende bevindingen in calciumbeeldvorming worden gevisualiseerd als een heatmap, zoals weergegeven in figuur 5D, of als afzonderlijke sporen voor individuele cellen, zoals weergegeven in figuur 5E. Het is belangrijk om te benadrukken dat de kleurstof alle celtypen zonder onderscheid labelt, daarom zijn specifieke stimuli essentieel om cellen te onderscheiden op basis van hun reacties. Om levensvatbare cellen te identificeren, gebruiken we KCl en sorteren we de cellen op basis van responsen die de gemiddelde baselinerespons met meer dan twee standaardfouten overschrijden. Bovendien kunnen plakjes worden gefixeerd en gekleurd, waardoor celtypen kunnen worden geïdentificeerd.
Figuur 1: Weefselbewerking en -snijden. (A) 1 g onbewerkt pancreasweefsel. (B) Schoongemaakte stukjes alvleesklier, klaar voor het inbedden van agarose. (C) Snijprocedure met behulp van een vibratoom. (D) Vers gesneden plakjes menselijke alvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gegevens over de levensvatbaarheid van het weefsel en de insulinesecretie. (A) Representatieve beelden van levensvatbare weefselplakjes. Projectie met maximale intensiteit van gereflecteerd laserlicht (grijs, linksboven), PI voor dode cellen (rood, linksonder), FDA voor levende cellen (groen, rechtsonder) en samengevoegde beelden voor levende en dode cellen (rechtsboven). De stippellijn geeft een eilandje aan. Schaalbalk 50 μm. (B) Dynamische insulinesecretie van plakjes menselijk pancreasweefsel van een enkele niet-diabetische donor. De insulinekinetiek vertoont een piekrespons in de eerste fase na 6 minuten stimulatie van hoge glucose, gevolgd door een plateau tweede fase. Gegevens worden genormaliseerd naar de gemiddelde baselinesecretie bij 5,5 mM glucose (stimulatie-index, vouwverandering). Secretie is uitgevoerd op plakjes van dezelfde donor zoals weergegeven in (A). (C) Representatieve beelden van niet-levensvatbare weefselplakjes. Projectie met maximale intensiteit van gereflecteerd laserlicht (grijs, linksboven), PI voor dode cellen (rood, linksonder), FDA voor levende cellen (groen, rechtsonder) en samengevoegde beelden voor levende en dode cellen (rechtsboven). De stippellijn geeft een eilandje aan. Schaalbalk 50 μm. (D) Dynamische insulinesecretie van plakjes menselijk pancreasweefsel van een enkele niet-diabetische donor. De insulinekinetiek toont een duidelijk verlies van zowel glucose-gestimuleerde insulinesecretie als membraandepolarisatie met KCl. De gegevens worden genormaliseerd naar de gemiddelde baseline-secretie bij 5,5 mM glucose (stimulatie-index, vouwverandering). Secretie is uitgevoerd op plakjes van dezelfde donor zoals weergegeven in (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Weefselbelasting voor dynamische perifusie. (A) Gestapelde plakkamers. Individuele plakjes worden op een metalen rooster geladen, zoals aangegeven in de bijsluiter. (B) Laden van geïsoleerde eilandjes in eilandjeskamers. Plak- en eilandjeskamers verbonden met perifusiemachine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hormoonsecretie in plakjes en geïsoleerde eilandjes. De gegevens in de panels (A) en (B) zijn afkomstig van een andere donor dan de panels (C) en (D). (A) Absolute hormoonsecretie van 3 plakjes pancreasweefsel van een enkele niet-diabetische donor. Insulinesecretie wordt weergegeven in groen en glucagonsecretie in magenta. (B) Hormoonsecretie weergegeven in (A) genormaliseerd naar het totale hormoongehalte (% van de inhoud). De inhoud wordt gemeten van alle 3 de plakjes die in het experiment zijn gebruikt. (C) Dynamische insulinesecretie van geïsoleerde eilandjes (100 eilandjes) en plakjes pancreasweefsel (3 plakjes) van dezelfde niet-diabetische donor. Gegevens worden weergegeven in absolute getallen (mU/L). (D) Insulinesecretie weergegeven in (C) genormaliseerd naar het totale insulinegehalte (% van de inhoud). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Beeldvormingsopstelling en verwachte resultaten. (A) Opstelling voor functionele beeldvorming met een rechtopstaande confocale microscoop en een perifusieopstelling. (B) Beeldvormingskamer aangesloten op in- en uitstroom. (C) Z-stapel confocale beelden van een eilandje in een weefselplak van een gezonde menselijke donor met gereflecteerd licht (boven) en Fluo4-signaal (onder). Reflectie wordt gebruikt om eilandjes binnen de plak te identificeren (stippellijn). (D) Heatmap met in vitro Ca2+- dynamiek van eilandjescellen, uitgedrukt als de fluorescerende intensiteit van Fluo4 genormaliseerd naar de basale signaalintensiteit bij 5,5 mM glucose en stimulatie met hoge glucose (16,7 mM). Elke rij vertegenwoordigt een enkele cel die in de loop van de tijd wordt gevolgd op de x-as en hun reactie in magnitudeverandering (%) van de fluorescerende intensiteit ten opzichte van de basislijn (dF/F) weergegeven in de kleurenschaal van blauw (lage intensiteit) tot rood (hoge intensiteit). (E) Representatieve sporen van 4 individuele cellen die reageren op hoge glucose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Instellingen voor calciumbeeldvorming. Screenshot van de software met representatieve instellingen die zijn gekozen om time-lapse-opnamen van 40 μm uit te voeren (XYZT-beeldvorming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier presenteren we een protocol om levensvatbare plakjes pancreasweefsel te genereren en het gebruik ervan voor functionele uitlezingen zoals dynamische hormoonsecretie en functionele beeldvorming. Net als bij de isolatie van menselijke eilandjes, wordt het succes van de slice-procedure beïnvloed door verschillende factoren, waaronder donorkenmerken, weefselverzendingstijd en weefselkwaliteit25,29. Daarom is het van cruciaal belang om weefselmonsters zorgvuldig te selecteren voor het experiment en de ischemietijden tot een minimum te beperken. In dit verband moeten andere potentiële bronnen van menselijk weefsel dan kadaverdonoren zorgvuldig worden overwogen. Het opnemen van chirurgische donoren biedt de mogelijkheid om functionele slice-gegevens te combineren met relevante in vivo informatie van dezelfde patiënt, waardoor de translationele relevantie wordt versterkt11. Deze weefselbron brengt echter andere factoren met zich mee, aangezien biopsieën meestal afkomstig zijn van oudere patiënten die een pancreatectomie ondergaan, meestal als gevolg van een gelokaliseerde tumor. Met name pancreasbiopten worden niet uitgevoerd in de context van diabetes.
Bij het uitvoeren van de eigenlijke snijprocedure is tijdige weefselverwerking van cruciaal belang. Plakjes kunnen enkele uren worden bewaard, zoals beschreven in dit protocol, of gedurende langere perioden worden gekweekt, zoals beschreven door Qadir et al.19. Op dit moment is dit protocol de enige methode om de levensvatbaarheid van plakjes gedurende langere perioden te behouden, maar toekomstige inspanningen zouden functionele veranderingen in verschillende cultuurtijden moeten beoordelen en vergelijkingen moeten trekken met geïsoleerde eilandjes, van dezelfde donor.
De meest kritische stap in het proces is een zorgvuldige weefselvoorbereiding voordat het in agarose wordt ingebed. Grote kanalen en fibrotisch weefsel kunnen het snijproces bemoeilijken en mogelijk leiden tot weefselblokkades die uit de agarose breken. Als dit gebeurt en de stukken redelijk groot blijven, kunnen ze opnieuw worden verwerkt en ingebed voor het snijden. Het handhaven van een goede weefselkwaliteit en zorgvuldige verwerking verbetert de efficiëntie van het snijproces aanzienlijk en levert de maximale kwantiteit en kwaliteit van plakjes op. De tijd die verstrijkt tussen weefselvoorbereiding en het genereren van plakjes mag niet langer zijn dan 2-3 uur, aangezien langere intervallen een aanzienlijke invloed hebben op de levensvatbaarheid van het weefsel.
Tijdens de perifusie van de plak is een eenvoudige maar cruciale stap het nauwkeurig bijsnijden van de plak om ervoor te zorgen dat deze perfect in de kamer past. Dit zorgt voor een goed baden van het weefsel en een ononderbroken stroom. Zodra het protocol is gestart, is het essentieel om verdere manipulatie van de kamers te voorkomen om ongewenste pieken in de hormoonafgifte te voorkomen. Er moet voldoende buffer worden voorbereid en de slang moet de bodem van de oplossing bereiken om te voorkomen dat de lucht wordt aangezogen en de kamers droogvallen.
Voor calciumbeeldvorming is het belangrijk om het interessegebied zorgvuldig te kiezen, afhankelijk van de experimentele behoeften en het ontwerp. Het is belangrijk om fotobleken tot een minimum te beperken door beeldvormingsparameters te kiezen die de blootstelling aan licht verminderen of de totale protocoltijd verkorten. Net als dynamische hormoonsecretie is het handhaven van een goede oplossingsstroom en een verwarmde instelling cruciaal, aangezien plakjes bijna fysiologische omstandigheden vereisen voor een optimale functie (bijv. 37 °C).
Plakjes pancreasweefsel behouden effectief de structurele integriteit van de alvleesklier, waardoor cel-celverbindingen tussen de verschillende celtypen behouden blijven. Bijgevolg bieden ze een alternatief voor het werken met geïsoleerde eilandjes, waardoor de gelijktijdige verkenning van zowel endocriene als exocriene functies en hun wisselwerking wordt vergemakkelijkt. Om het samenspel van individuele celtypen te beoordelen, is het cruciaal om onderscheid te maken tussen hen. Kleuring daarna is een optie, maar het heeft beperkingen in termen van beschikbare fluorescerende sondes en de uitdaging om exacte cellagen te lokaliseren. Daarom is het raadzaam om celspecifieke stimuli in het protocol op te nemen om celdiscriminatie op basis van reacties mogelijk te maken. Voor het onderscheiden van celtypen in plakjes muis of mens, omvatten effectieve stimuli adrenaline voor alfacellen21,30, ghreline voor deltacellen31, ceruleïne voor acinaire cellen 5,32, galzuren voor ductale cellen33 en noradrenaline voor vasculaire cellen22. Soortgelijke stimuli kunnen worden gebruikt voor het meten van secretoire reacties. Terwijl beeldvormingsstudies zich richten op individuele cellen, analyseren secretiestudies de collectieve respons. Daarom is het van cruciaal belang om een ruim aantal plakjes op te nemen om de gewenste resultaten te detecteren. De optimale hoeveelheid kan variëren tussen celtypen, waarbij drie plakjes voldoende blijken te zijn voor endocriene cellen; Het is echter raadzaam om meer plakjes te gebruiken om de detecteerbaarheid te garanderen in plaats van het risico te lopen waardevolle informatie te missen.
Net als elke andere methode hebben weefselplakjes beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van resultaten. Stimulustoepassing gericht op specifieke celtypen kan leiden tot effecten op andere celtypen in het segment, waardoor mogelijk feedbacklussen worden geactiveerd. Die zijn echter ook belangrijk om te bestuderen en daarom kunnen gemeten reacties meer representatief zijn voor een fysiologische respons. Voor selectieve celtargeting kunnen traditionele in-vitroprotocollen worden gebruikt. Belangrijk is dat acinaire cellen pancreasenzymen bevatten die eiwitten kunnen afbreken en het weefselplakje kunnen verteren, wat resulteert in cellulaire afbraak binnen enkele uren. Om de levensvatbaarheid te behouden, is het consistente gebruik van trypsineremmers essentieel wanneer plakjes zich in een statische toestand bevinden, ook al kan hun toepassing de succesvolle overdracht van virussen die voor etiketteringsdoeleinden worden gebruikt, verstoren.
Vergeleken met eilandjesisolatie kunnen donorvariabiliteit en weefselkwaliteit van invloed zijn op zowel de kwantiteit als de levensvatbaarheid van de verkregen plakjes. Onvoldoende levensvatbaarheid na het snijden kan leiden tot een korte levensduur en het vermogen om de plakjes te kweken belemmeren. Bovendien kan het aantal eilandjes aanzienlijk variëren tussen donoren, waardoor het een uitdaging is om de inhoud van eilandjes te schatten voordat experimenten worden uitgevoerd. Daarom zijn een zorgvuldige selectie van donoracceptatiecriteria en de implementatie van geschikte normalisatiemethoden, zoals het percentage hormooninhoud voor secretie of vouwverandering ten opzichte van de uitgangswaarde, van cruciaal belang. Voor consistente resultaten wordt geadviseerd om de levensvatbaarheid van weefselplakjes vóór het experiment te beoordelen. Bovendien wordt aanbevolen om relevante controlestimuli (bijv. KCl) in het experiment op te nemen. In gevallen van individuele celanalyse, zoals beeldvorming, kan het voorsorteren van cellen op basis van hun reactie op deze controlestimulaties worden geïmplementeerd. Ondanks de genoemde uitdagingen bieden slices een waardevolle aanvulling op de huidige onderzoeksmethoden.
Het beschreven protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt voor verschillende toepassingen, en plakjes alvleesklier kunnen worden gemanipuleerd en reacties kunnen worden onderzocht na een verscheidenheid aan stimuli. We verwijzen lezers ook naar tal van onderzoeken waarbij plakjes muis of menselijke alvleesklier worden gebruikt, wat waardevolle inzichten biedt voor degenen die hun experimenten plannen. In de toekomst is het mogelijk dat mogelijke therapieën worden onderzocht met behulp van plakjes alvleesklier of dat ziektemechanismen worden gemodelleerd.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is uitgevoerd met steun van het Netwerk voor Pancreasorgaandonoren met Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), een gezamenlijk onderzoeksproject naar diabetes type 1, ondersteund door JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) en The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). De inhoud en geuite meningen vallen onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) die samenwerken met nPOD om onderzoeksbronnen te verstrekken, staan vermeld op http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. De auteurs zijn de donateurs en hun families dankbaar voor hun onschatbare bijdrage. Dit werk werd ondersteund door de American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) en de Leona M. en Harry B. Helmsley Charitable Trust (subsidie 2015-PG-T1D-052).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
| AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
| AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
| AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
| Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
| Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
| Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
| Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
| Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
| Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
| Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
| Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
| Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
| Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
References
- Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Lyon, J., et al. Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore. Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Marolt, U., et al. Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices. PLoS One. 17 (6), 0268644 (2022).
- Stozer, A., et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62293 (2021).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 8 (1), e54638 (2013).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp. Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Rep. 31 (1), 107469 (2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
- Campbell-Thompson, M., et al. Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).
- Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).
- Pugliese, A., et al. New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation. Curr Diab Rep. 14 (10), 530 (2014).
- Pugliese, A., et al. The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings. Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nat Commun. 11 (1), 3265 (2020).
- Huber, M. K., et al. Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62207 (2021).
- Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes. Cell Rep. 41 (11), 111792 (2022).
- Mateus Goncalves, L., Almaca, J. Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519 (2020).
- Doke, M., et al. Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage. Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).
- Mateus Goncalves, L., et al. Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes. Cell Rep. 42 (8), 112913 (2023).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).
- Hart, N. J., Powers, A. C. Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions. Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).
- Henquin, J. C. The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets. Mol Metab. 30, 230-239 (2019).
- Panzer, J. K., Caicedo, A. Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue. STAR Protoc. 4 (3), 102399 (2023).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), e78706 (2013).
- Gal, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Front Physiol. 10, 938 (2019).
