Summary
Her beskriver vi en prosedyre som muliggjør organomfattende påvisning av sykdomsfremkallende bakterier under infeksjon og kvantifisering av fluorescerende reporteraktiviteter.
Abstract
De fleste infeksjoner finner sted i tredimensjonalt vertsvev med intrikat anatomi og lokalt varierende vertsfysiologi. Plasseringen av patogenceller i dette mangfoldige miljøet påvirker deres stressnivåer, responser, skjebne og bidrag til den generelle progresjonen av sykdommen og behandlingssvikt betydelig. På grunn av de tekniske vanskelighetene med å lokalisere μm-store patogenceller i cm-store vertsorganer, har dette forskningsområdet imidlertid vært relativt uutforsket. Her presenterer vi en metode for å møte denne utfordringen. Vi bruker seriell to-fotontomografi og AI-forbedret bildeanalyse for å lokalisere individuelle Salmonella-celler gjennom hele milten, leverlappene og hele lymfeknuter til infiserte mus. Ved å bruke fluorescerende reportere og in vivo antistoffadministrasjon kan replikasjonshastigheten til enkelt Salmonella-celler , deres lokale interaksjon med spesifikke immunceller og bakterielle responser på antibiotika bestemmes. Disse metodene åpner veier for en omfattende undersøkelse av infeksjoner, forebygging og behandling av dem innenfor den tredimensjonale vevskonteksten.
Introduction
Infeksjoner forekommer i vev med kompleks anatomi og oppdelt fysiologi. De forskjellige mikromiljøene som eksisterer side om side i det infiserte vevet kan bestemme skjebnen til lokale patogenundergrupper og deres bidrag til det generelle sykdomsutfallet 1,2,3. Imidlertid er omfattende 3D-kartlegging av mikrobielle patogener i vev i cm-størrelse fortsatt utfordrende4. Avbildning av hjernen og andre organer er et svært aktivt forskningsfelt med stadig forbedrede eksperimentelle strategier5, men mange metoder mangler fortsatt sub-μm-oppløsningen som ville være nødvendig for å identifisere μm-store bakterielle patogener trygt. I motsetning til dette muliggjør seriell to-foton (STP) tomografi6 automatisert flerfarget, deformasjonsfri avbildning av hele vev med sub-μm oppløsning i planet, noe som gir fulle volumetriske datasett. Denne metoden kombinerer gjentatt fysisk seksjonering av vevet ved hjelp av et vibratom med intermitterende to-foton-avbildning av de nye blokkflatene med infrarødt lys. STP-tomografi har blitt mye brukt for å kartlegge tynne aksoner i hjernen for å etablere tilkoblingskart 7,8,9,10.
STP-tomografi muliggjør også 3D-kartlegging av individuelle mikrobielle patogenceller (Salmonella, Toxoplasma) i hele det infiserte vevet11,12 ved hjelp av en tomograf. Andre harmoniske generasjon avslører kollagenskjeder rundt arterier og i fibrøse bånd som miltens trabekler, og gir dermed anatomisk kontekst. In vivo injiserte fluorescerende antistoffer kan brukes til å farge vertsceller for å avsløre interaksjoner mellom individuelle patogenceller og infiltrerende immunceller som nøytrofiler. Her beskrives rørledningen som involverer prosessering av vevet, bildebehandling, søm av bildebrikker med belysningskorreksjon, stabling av bilder i tre dimensjoner og segmentering ved hjelp av maskinlæringsverktøy. Denne rørledningen gir 3D-posisjoner av individuelle patogener, celler og mikrokolonier innenfor deres vertskontekst. Å telle antall individuelle celler i mikrokolonier er fortsatt vanskelig på grunn av oppløsningsgrenser, men slike tall kan estimeres basert på den integrerte lysstyrken til mikrokolonien. Rørledningen kan enkelt tilpasses andre infeksjonsmodeller hvis rekombinante GFP- eller YFP-uttrykkende patogener er tilgjengelige.
Protocol
Alle dyreforsøk som er beskrevet her er godkjent av myndighetene (lisens 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) og følger lokale retningslinjer (Tierschutz-Verordnung, Basel) og den sveitsiske dyrevernloven (Tierschutz-Gesetz).
1. Klargjøring og lagring av infisert vev
- Bruk en valgfri infeksjonsmodell. Her er 10 til 16 uker gamle mus av begge kjønn infisert med ~1,000 kolonidannende enheter (CFU) ved intravenøs injeksjon eller 5 x 107 CFU ved intragastrisk administrering med en rundspissnål. Egnede musestammer inkluderer BALB/c og C57BL/6.
MERK: Den samme tilnærmingen kan enkelt tilpasses for andre vertsarter. - Sørg for at patogener uttrykker fluorescerende proteiner for å muliggjøre identifikasjon i ufarget vev. Patogener som uttrykker GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 eller mWasabi16 kan alle visualiseres ved hjelp av 940 nm eksitasjon17. Salmonella som uttrykker mCherry18 på nivåer som lett kan påvises ved flowcytometri19 , kan avbildes ved bruk av 800 nm eksitasjon, men har dårlige signal-til-bakgrunnsforhold i infisert milt og lever som viser betydelig autofluorescens.
- Sørg for at alle de fluorescerende proteinene beholder >70 % av fluorescensintensiteten etter fiksering med paraformaldehyd ved nøytral pH basert på kvantifisering med flowcytometri. Her brukes infisert musevev, nemlig milt, lever, lymfeknuter og Peyers.
- Farg vertscelleoverflatemarkører in vivo ved å injisere phycoerythrin (PE)-merkede antistoffer 10 minutter før perfusjon. For å farge nøytrofiler, injiser intravenøst 4 μg anti-Ly-6G-PE i 100 μL PBS. For å farge makrofager i marginalsonen i milten, injiser 4 μg anti-CD169-PE i 100 μL PBS (se materialtabell).
- Fikser infisert vev gjennom standard transkardial perfusjon20 med 15 ml iskald 50 mM fosfatbuffer (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), etterfulgt av 35 ml 4 % paraformaldehyd (PFA; fiksativ) i PB (figur 1A).
- Kort sagt, administrer dyp anestesi til det infiserte dyret ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg/kg ketamin og 16 mg/kg xylazin. Sørg for riktig bedøvelse ved å bekrefte tap av tåklemmerefleksen.
- Desinfiser pelsen med 70% etanol, tørk den med et sterilt papirhåndkle, og åpne brystet kirurgisk med pinsett og saks. Plasser en steril nål i venstre ventrikkel i hjertet, åpne høyre atrium med steril saks, og kjør den første bufferen og deretter fikseringsmidlet gjennom nålen, venstre ventrikkel og hele det vaskulære systemet ved hjelp av en pumpe. Dette fikser alt vev raskt og jevnt og forårsaker eutanasi.
- Samle vevet etter perfusjon, inkuber det i 20x volum av 4 % kaldt paraformaldehyd i PB-buffer og legg det på en shaker ved 4 °C over natten (figur 1B). Avbildning er mulig for vev i størrelsesområdet 0,05 til 2 cm3. For større vev, kutt i passende biter.
- Neste dag, vask vevet 3 ganger i 10 minutter hver med PB-buffer med risting ved 40 rpm ved romtemperatur for å fjerne PFA.
NOTAT: På grunn av PFA-toksisitet må disse trinnene utføres inne i et avtrekksskap. Kast PFA-avfallet i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Fjern overflødig PB-buffer og tilsett 20x volum kryobeskyttende lagringsbuffer21 (876 mM sukrose, 0,25 mM polyvinylpyrrolidon, 40 % (v/v) etylenglykol, oppløst i 50 mM PB-buffer) til prøven med risting ved 40 rpm ved 4 °C i 6-8 timer eller til vevet synker til bunnen. Inkuber samples ved -20 °C i minst 3 dager for å sikre effektiv reduksjon av vevsautofluorescens11. Prøver kan brukes i opptil 5 år ved oppbevaring ved -20 °C.
NOTAT: Synking av vevet indikerer riktig penetrering av lagringsbufferen i vevet.
2. Eksempel på innbygging
- Legg vevet inn i en agaroseblokk for jevn skjæring med et vibratom. Preaktiver agarosen kjemisk ved oksidasjon med periodat og reduser deretter med borhydrid for å danne tverrbinding med vevet for forbedret stabilitet under skjæreprosessen. Utfør trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Forbered 4% oksidert agarose ved å veie 2,25 g agarose og tilsett 0,21 g NaIO4. Tilsett 100 ml PB til agarose og NaIO4. Rør ved romtemperatur i en avtrekkshette i 2-3 timer med beskyttelse mot lys.
NOTAT: Kritisk trinn: Ikke overskrid omrøringen i mer enn 3 timer, ellers vil agarosen polymerisere dårlig. - Gjenvinn agarosen ved membranfiltrering i et standard vakuumfilter med en 0,2 μm membran. Fjern gjenværende NaIO4 ved å vaske 3x med 50 ml PB-buffer. Resuspender den oksiderte agarosen i 50 ml PB-buffer.
NOTAT: Ikke smelt agarosen i løpet av denne stage. Agarosen kan lagres ved 4 °C i opptil 2-3 uker beskyttet mot lys. - Forbered borhydridoppløsning ved å tilsette 19 g boraks og 3 g borsyre til 1 L vann. Rør til det er oppløst og juster pH til 9-9,5 med 1 M NaOH. Varm opp 100 ml boratbuffer til 40 °C på en røreplate i et avtrekksskap. Tilsett 0,2 g NaBH4 og rør i 15-30 minutter mens du beskytter mot lys.
NOTAT: Borhydridløsningen kan oppbevares i flere uker ved romtemperatur i mørket. Kritisk trinn: Når du tilsetter NaBH4 til boratbufferen, vil det dannes gass, og utfør derfor dette trinnet inne i et avtrekksskap. Ikke gjør dette trinnet i en tett forseglet beholder fordi det kan føre til en eksplosjon. - Ta vev fra fryseren etter tilstrekkelig inkubasjon for redusert autofluorescens (≥ 3 dager), fjern overflødig lagringsbuffer for kryobeskyttende midler, og vask vevet 3x i 10 minutter hver med PB-buffer med risting ved 40 rpm ved romtemperatur (RT).
- Smelt ca. 20 ml oksidert agarosesuspensjon (tilberedt i trinn 1) i en mikrobølgeovn (700 W i ~30 s), la den avkjøles nok til å håndtere (~45 °C), og hell den i en plastform.
NOTAT: Kritisk trinn: Ikke tilsett agarosen direkte etter oppvarming i mikrobølgeovnen på prøven, dette kan føre til ødeleggelse av vevet. - Bruk en pinsett til å plukke forsiktig opp vevet og sett det raskt inn i bunnen av agarosen. Inkuber formen ved RT i 15 minutter for å la agarosen polymerisere.
- Etter agarosepolymerisering, åpne plastformen med en skalpell fra de fire hjørnene og plukk forsiktig opp agarosekuben med hanskede fingre.
- Senk prøven i borhydridoppløsning (tilberedt i trinn 2) i 2-3 timer ved 4 °C for å starte tverrbinding av den oksiderte agarosen og vevet. Dette forhindrer at vevet løsner under seksjonering.
MERK: Kritisk trinn: Den nedsenkede prøven i borhydrid bør inkuberes beskyttet mot lys ved 4 °C. - Vask agarosekuben med PB-buffer 2x i 10 min. Snu agarosekuben slik at vevet er på oversiden og fest blokken til et magnetisk objektglass (mikroskopglass med to magneter festet på baksiden) ved hjelp av noen dråper øyeblikkelig lim. Det tar 10-20 minutter før limet stivner, så legg et papirvev med dråper PB-buffer på toppen av agarosen og sørg for at prøven forblir tilstrekkelig hydrert hele veien (figur 1C).
3. Forberedelse av mikrotomen og sette scenen
- Plasser den magnetiske sleiden på metallet i midten av sample boksen til tomografen.
- Fyll boksen med PB-buffer og plasser den forsiktig på stage og stram skruen til venstre for å feste sample boksen på stage av tomografen.
NOTAT: Ikke stram skruene for mye, ellers vil det skade plastboksen. - Plasser bladet på mikrotomen og skift posisjonen til sample forsiktig nær og under mikrotomet. Den øvre overflaten av agarosen skal være på samme nivå som bladet til mikrotomet.
NOTAT: Å plassere den for lavt vil kaste bort skjæretid, mens å plassere den for høyt vil fjerne en stor del av blokken ved første kutt. - Flytt scenen for å plassere agarosekuben til midten av målet og klikk gjentatte ganger på Slice-knappen i tomografprogramvaren til du får en intakt skive av hele agarosekuben.
4. Tildeling av overflaten og innhenting av 2D-bilder
- Sentrer objektivlinsen på vevsprøven i x- og y-retninger.
- Åpne laserprogramvaren og slå på laseren i programvaren. Når du hører en tikkende lyd, slå på laserbryteren og juster bølgelengden til 800 nm.
NOTAT: Laserkilden må varmes opp i minst 30 minutter, ideelt sett 1 time, før bildebehandling. - Lukk skapdørene til mikroskopet, slå av alle lyskilder i rommet, og slå på PMT-ene og sett spenningen til 750 V.
NOTAT: Kritisk trinn: PMT-er er svært følsomme for lys, hold det av med mindre skapdørene er lukket og alle lyskildene i rommet er slått av. - Juster protokollinnstillingene til tomografprogramvaren som skissert, og sett mikroskoplukkeren til automatisk og voltage til 20 og 3 for henholdsvis V1 og V2.
- Klikk på 2D-knappen i tomografprogramvaren for å ta et bilde av prøven.
- Når et bilde med synlig autofluorescens vises, justerer du z-piezoen for å sette fokalplanet på agarosekubens overflate. Den første skanningen vil være 20 μm under overflaten for å få et stabilt bilde av prøven.
- Hvis ingen autofluorescensbakgrunn er synlig, øker du kontrasten til et signal vises. Det kan oppstå at det ikke er noe synlig signal (dvs. på grunn av agarosen på toppen av vevet). I dette tilfellet justerer du z-aksen ved hjelp av z-piezo-enheten til den når agaroseoverflaten. Manuell bevegelse av linsen kan være nødvendig hvis ønsket posisjon er utenfor rekkevidden til z-piezo-enheten.
- Skjær flere 50 μm skiver etter å ha funnet overflaten av prøven, og ta 2D-bilder etter hvert kutt for å sikre at fokalplanet er riktig satt på blokkoverflaten.
5. Finne kantene på prøvene og sette laseren til startpunktet
- Basert på xy-koordinatene til laserskanningsområdet (4 hjørnekoordinater), begrens bildeområdet til vevet med minimal avbildning av den omkringliggende agaroseblokken.
- Slå av PMT-ene, sett laserbølgelengden til 800 nm, bytt laserlukkeren til å åpne. Posisjonen til laserlys som kommer inn i agaroseblokken er synlig som en rød flekk av spredt lys (Figur 2A,B).
Kritisk trinn: Vær spesielt forsiktig med klasse 4-laseren. Det kan raskt skade menneskelig vev og øyne. Personalet trenger spesiell opplæring for å betjene et slikt instrument trygt. - Bruk laserpunktet mens du flytter scenen for å finne koordinatene til vevskantene ved å bruke sekvensen bakover, høyre, foran og venstre.
- Dobbeltsjekk koordinatene og plasser laserpunktet i høyre hjørne foran, som er standard utgangspunkt for avbildning av vevet.
- Konverter koordinatene fra konsollvinduet til maskingjenkjennelige blokkstørrelser, som er definert av xy-trinnene. Legg inn disse trinnmålingene i protokollen til programvaren. Lukk skapdørene.
6. 3D skanning / seksjonering
- Endre bølgelengden til 940 nm for å eksitere GFP, mWasabi eller YPet og PE.
NOTAT: Laseren er usynlig for det menneskelige øyet ved denne bølgelengden. For å forbedre signal-til-bakgrunn for GFP, mWasabi og den grønne emitterende komponenten i TIMERbac, sett et smalt båndpassfilter 510/20 nm foran PMT 2. Dette reduserer interferens av grønn-gult vev autofluorescens. - Sett mikroskoplukkeren til automatisk modus, og lukkerspenningsinnstillingene til 20 for V1 og 1.71 for V2.
- Juster følgende tre parametere i programvaren: Seksjonstykkelse - for de fleste formål, satt til 50 μm. For lever, sett til 30 μm på grunn av begrenset bildedybde. Antall fysiske seksjoner - dette bestemmer den totale vevsdybden som skal avbildes, sett deretter. Antall fly som skal fanges for hver seksjon - dette vil bestemme z-oppløsningen. Bruk 5 plan (som gir 10 μm vertikal oppløsning) til de fleste formål. For lever, bruk 3 eller færre fly.
- Still inn laserforsterkningen. Dette må testes empirisk for forskjellige vev og skannedybder.
- Definer mappebanen og navnet for lagring av de innhentede bildene, og oppgi riktig informasjon for bildemetafilen.
- Dobbeltsjekk alle de angitte verdiene.
- Klikk på 3D-mosaikkinnstilling for å starte skanneprosessen (Figur 1D).
- Etter at avbildningen er fullført, samle vevsdelene forsiktig fra vanntanken og oppbevar dem i lagringsbuffer ved -20 °C til videre bruk (figur 1E; Figur 2C,D).
7. Bildebehandling og dataanalyse
- Last ned MATLAB-skriptene på en Linux-datamaskin fra https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Kopier skriptene til en mappe, for eksempel /home/user/Program/.
MERK: Computer Vision Toolbox-tillegget for MATLAB og Fiji (eller ImageJ) må være installert på Linux-datamaskiner for at skriptet skal fungere fullt ut. - Sy sammen flisbilder som beskrevet nedenfor.
- Overfør data fra tomografserveren til Linux-datamaskinen.
- Åpne MATLAB-skriptet StepOneStitchingAndArchive.m og finn kildemappen som inneholder rådataene. Definer kilde- og målmappene i skriptet.
- Bytt til Editor-fanen og klikk på Kjør. Fremdriftsinformasjon vises i kommandovinduet. Behandlingen inkluderer lesing av informasjon fra Mosaic-filen, generering av flisindeks før bildesøm, korreksjon av bakgrunnsbelysning med Cidre22 (figur 3) samt belysningskorreksjon mellom optiske lag hentet på forskjellige dybder. Finn de sammensatte bildene i en undermappe kalt stitchedImages_100 i kildemappen. Komprimer rådataene for langtidslagring ved hjelp av tar-kommandoen og lagre som en enkelt fil med filtypen tar.bz2 (Figur 1F).
- Utfør modelltrening og segmentering med støttevektormaskin. Følg trinnene nedenfor for å trene støttevektormaskinen og utføre segmenteringen.
MERK: De sammensatte bildene for hver av de tre fluorescenskanalene lagres i 3 undermapper (kalt 1, 2 og 3, tilsvarende rød, oransje og grønn fluorescens) i stitchedImages_100. Hver undermappe inneholder alle de sammensatte bildene fra samme kanal.- Forhåndsvis de sammensatte bildene. Åpne ett bilde med samme filnavn fra hver undermappe med Fiji (eller ImageJ). Slå sammen de tre kanalene til ett fargebilde. Juster lysstyrken til hver kanal til klare signaler sees fra bakterier og vevsautofluorescens. Legg merke til det justerte maksimale intensitetsnivået for hver kanal for neste trinn.
- Åpne MATLAB-skriptet StepTwoSegmentationAndAnalysis.m og bla til kilden. Definer kildemappen og bildenavnene for opplæring. For eksempel
sourceD = '/' ;
red_name = [kildeD '1/section_020_01.tif']; green_name = [kildeD '2/section_020_01.tif'];
blue_name = [kildeD '3/section_020_01.tif']; - Gå til Editor-fanen og klikk på Kjør.
- En dialogboks som ber om fargeterskler vil dukke opp, fyll den basert på tidligere manuell sjekk med Fiji (trinn 7.3.1).
- Velg regioner for bakgrunn og regioner av interesse (dvs. bakterier) i henhold til dialogboksene. Grafer vil vises som viser hvor godt modellen har blitt trent og spør om flere regioner må legges til. Legg til flere områder av interesse og bakgrunn til bakteriene kan segmenteres tydelig (figur 4A,B).
- Navngi og lagre modellen. Skriptet vil automatisk laste inn bildene og bruke et medianfilter (radius 2 piksler).
- Segmenteringsprosessen kjører automatisk, og fremdriftsinformasjon vises i kommandovinduet. Se fremdriften i segmenteringen. Hvis segmenteringen ikke fungerer bra med modellen på andre sammensatte bilder, gjenta modelltreningen for å inkludere flere bakgrunns- og bakterieområder.
- Hvis du vil se resultatene av segmenteringen, kontrollerer du filen som heter Allpositions_filter3D.txt. Denne filen inneholder koordinatene til tyngdepunktet for hver bakterie eller bakteriell mikrokoloni og den tilsvarende integrerte fluorescensintensiteten (figur 1G).
- Fjern flere artefakter med konvolusjonelt nevralt nettverk som beskrevet nedenfor.
MERK: For noen bakterier inkluderer enkel segmentering med støttevektormaskinen fortsatt noen bildeartefakter. Dette gjelder spesielt for YPet-uttrykkende bakterier. Nevral nettverksbasert segmentering kan effektivt fjerne disse artefaktene (figur 4C). Computer Vision Toolbox-tillegget for MATLAB og Fiji (eller ImageJ) må være installert på Windows-datamaskiner for at skriptet skal fungere fullt ut. Hvis du vil ha informasjon om det underliggende nevrale nettverket, kan du se: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html- Forbered bildene. Konverter tif-filer til jpg-filer med forskjellige lysstyrkejusteringer ved hjelp av Fiji. Identifiser med manuell kuratering minst 600 bakterier og 600 artefakter og sikre beskårne bilder av disse objektene i passende mapper.
- Åpne MATLAB-skriptet CNNtestV4.m og bla til kildefilene som inneholder objektbildene i trinn 7.4.1.
- Definer bildemappen for opplæring. For eksempel
digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
Definer antall bilder for opplæring, for eksempel numTrainFiles = 600. - Gå til Editor-fanen og klikk på Kjør. Etter trening lagres CNN-modellfilen som gregnet1.mat i kildemappen.
- Definer en mappe med testbilder. For eksempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultatene lagres i en fil YourFile.txt som inneholder informasjon om bildenavnet og klassifiseringen som bakterier eller artefakter. - Definer mappe med testbilder. For eksempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultatene vil bli lagret i en fil YourFile.txt, som inneholder informasjon om bildenavnet og klassifiseringen som bakterier eller artefakter.
- Beregn størrelsen på mikrokolonier basert på fluorescensintensiteten til enkeltbakterier som beskrevet nedenfor.
NOTAT: Den romlige oppløsningen til tomografen er utilstrekkelig til å løse individuelle bakterieceller i tettpakkede mikrokolonier. Imidlertid kan antall bakterier i hver mikrokoloni estimeres basert på den totale fluorescensen til mikrokolonien i forhold til fluorescensen til enkeltbakterier. Denne estimeringsnøyaktigheten avhenger av homogeniteten til fluorescensintensiteten på tvers av bakteriepopulasjonen.- Bekreft identiteten til GFP-positive hendelser i STP-tomografien ved å farge bakterielle komponenter som lipopolysakkarid ved hjelp av immunhistokjemi av hentede seksjoner fra tomografen (figur 1H; Figur 5).
- Identifiser minst 30 enkeltbakterier og hent deres fluorescensintensitet fra de tilsvarende segmenteringsresultatene. Bruk median intensitetsverdi som referanse for en enkelt bakterie. Beregn bakterietallet til hver mikrokoloni ved å dele den totale fluorescensintensiteten til mikrokolonien med referanseverdien for en enkelt bakterie (figur 1I).
- Utfør 3D-rekonstruksjon med visualiseringsprogramvare som beskrevet nedenfor.
- Forberedelse av bilder
- Ta de blå kanalbildene, som inneholder andre harmoniske signaler av kollagen som gir en nyttig anatomisk referanse, inkludert vevskapsler, arterier og trabekler. Bruk bilder segmentert for bakterier som 2.
- Samle bildene fra 1kanal 10 ganger i både x- og y-akser og lagre de reduserte bildene i en ny mappe. Lag 3 replikater av reduserte bilder i samme mappe. Navnet på nye replikater bør beholde samme sekvens. For eksempel: section_001_01.tif, repliker 1 med navnet section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Bruk disse trinnene også på bildene fra 2. Nedbemanningen gir mer håndterbare filstørrelser. Trippelbildene vil jevne ut z-aksen.
- Slå sammen bildene fra hver kanal for å danne bildestabler med Fiji. Klikk Bilde > Stabler > Verktøy > Stabelsortering > Sorter etter etiketter.
- Utfør 3D-filtrering. Klikk på Behandle > filtre > 3D-filteret og angi Z-filterstørrelsen som 6. Lagre bildestablene.
- Utfør 3D-visualisering som beskrevet nedenfor.
- Åpne visualiseringsprogramvarepakken i Arena-visningen (standardinnstilling). Bruk klokkemappeikonet for å legge til mapper i Arena-visningen. Dobbeltklikk for å åpne *.ims- eller *.tif-filen (klargjort i 7.6.1).
- Bruk Rediger>Bildeegenskaper til å justere fargerepresentasjonene (LUT-er) for de forskjellige kanalene i vinduet Skjermjustering.
- Klikk på Avansert for å stille inn min/maks-verdiene manuelt og en verdi for gammakorreksjon.
Klikk på kanalnavnene for å endre navnene og LUT-ene. - Når du har justert utseendet til bildet, eksporterer du gjeldende visning ved hjelp av øyeblikksbildeverktøyet.
- Bruk animasjonsikonet til å representere 3D-dataene som en film. Bruk navigasjonspekeren til å finne et perspektiv/visning og zoome, og bruk + Legg til for å legge til nøkkelbilder. Flytt til en annen posisjon og legg til neste nøkkelbilde. Trykk på den røde opptaksknappen for å lage filmen. Lagre den i ønsket målmappe og filtype (Figur 1J).
- Forberedelse av bilder
Representative Results
Den beskrevne prosedyren muliggjør påvisning av individuelle Salmonella-celler i hele museorganer som milt, lever, mesenteriale lymfeknuter og Peyers plaster11 (figur 5 og figur 6). Den oppdager også Toxoplasma gondii-parasitter i musehjerne12. Noen infiserte vev, inkludert lever, Peyers flekker og milt, avgir betydelig autofluorescens i det grønn-gule området. Autofluorescens forbedres ytterligere ved fiksering med paraformaldehyd, som er nødvendig for å bevare vevsstrukturen. Deteksjon av grønn fluorescens fra GFP, mWasabi og den grønne komponenten i TIMERbac mot denne autofluorescensbakgrunnen forbedres ved å sette et smalt båndpassfilter 510/20 nm (som overfører de fleste GFP-utslipp, men blokkerer en stor del av autofluorescensspekteret) foran fotomultiplikator 2 (som samler grønne utslipp) og ved å redusere vevsautofluorescens ved å lagre fast vev i 3 eller flere dager i kryobeskyttende middel11. Imidlertid bør bakterier fortsatt uttrykke minst noen få tusen kopier per celle av GFP eller andre fluorescerende proteiner. På den annen side bør for høye fluorescerende proteinnivåer unngås for å minimere treningskostnader som kan føre til svekket virulens23.
Korrekt segmentering av fluorescerende bakterier i vevet kan bekreftes ved immunhistokjemi av uthentede vevssnitt etter bildediagnostikk. Nærmere bestemt kan gjenstander farget med et antistoff mot bakterielle overflatekomponenter som lipopolysakkarid justeres med fluorescensbildet oppnådd ved STP-tomografi (figur 5). Det er viktig å merke seg at noen fargede Salmonella-celler mangler fluorescerende proteiner og dermed påvisbar fluorescens i både konfokalmikroskopi og STP-tomografi. Disse cellene er Salmonella som har blitt drept av vertens immunsystem som demonstrert ved flowcytometrisk sortering og vekstkulturer fra enkeltsorterte celler, samt den nære korrelasjonen mellom antall kolonidannende enheter på agarplater og antall fluorescerende Salmonella-celler som bestemt ved flowcytometri24. I tillegg kan tap av plasmid resultere i ikke-fluorescerende levedyktige celler, og dette må testes ved plettering på medier med og uten passende antibiotika som tilsvarer seleksjonsmarkøren på plasmidet. For pSC101-avledede plasmider er plasmidtap in vivo sjeldent19. For de fleste kromosomintegrerte ekspresjonskassetter som sifB::gfp brukt i11, er tap av ekspresjon uoppdagelig in vivo. Hvis segmenteringen er inkonsistent med immunhistokjemidata, må segmenteringsrørledningen endres.
Oppløsningen av STP-tomografi er utilstrekkelig til å løse individuelle bakterieceller i tettpakkede mikrokolonier. Imidlertid muliggjør den totale fluorescensintensiteten til mikrokolonien estimering av antall Salmonella-celler . Dette krever en fluorescerende stamme med svært homogene fluorescensnivåer som Salmonella sifB::gfp11. Ved å kombinere det estimerte antallet Salmonella-celler for alle mikrokolonier og enkeltceller gir total bakteriell vevsbelastning som er i samsvar med alternative metoder som plettering eller flowcytometri av vevshomogenater11. Plating og flowcytometri kan ikke gjøres direkte fra samme vev fordi de må perfusjonsfikseres for STP-tomografi. I stedet må de gjøres med flere dyr som ikke er fikset. Hvis median bakteriebelastning som bestemt av de forskjellige tilnærmingene avviker mer enn 3 ganger, kan levedyktigheten til fluorescerende bakterier bli kompromittert (i tilfelle lavere kolonidannende enheter) eller noen bakterier kan ha mistet den fluorescerende reporterkonstruksjonen (i tilfelle høyere kolonidannende enheter). Kontrolleksperiment vil være nødvendig for å identifisere kilden til slike avvik.
STP-tomografi gir lokalisering av bakterieceller i 3D-strukturen til det infiserte vevet. De andre harmoniske signalene fra kollagen gir anatomiske landemerker som arterier og trabekler. I tillegg kan vertsceller farges in vivo ved å injisere et antistoff mot overflatemarkører før perfusjon (figur 5 og figur 6). Denne fargingen gir ytterligere landemerker for vevsrom og spesifikke mikromiljøer, inkludert betennelsesfoci (intracellulære markører og noen rom med diffusjonsbarrierer som milthvit masse eller hjernen er ikke lett tilgjengelige, egnet for denne in vivo-farging ). Denne tilnærmingen avslørte den hvite miltmassen som et vevsrom som muliggjør langsiktig overlevelse av Salmonella under antimikrobiell kjemoterapi11.
Til slutt kan Salmonella-replikasjon med moderate eller langsomme hastigheter identifiseres og lokaliseres innenfor 3D-strukturen til vev ved hjelp av stammer som uttrykker timerbac, en enkeltcellereporter for replikasjonshastighet11,15.
Figur 1: Prosedyre for helorganavbildning ved bruk av seriell to-foton (STP) tomografi. (AB) Organet høstes etter transkardiell perfusjon og lagres over natten i 4 % paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C. (C-E) Organet er innebygd i oksidert agarose og tverrbundet, deretter skannes og skjæres vevet ved hjelp av STP-tomografi. Skivene samles inn for påfølgende immunhistokjemi. (F-J) Beregningsanalysepipelines for kvantifisering av bakterieantall, bekreftelse av fluorescerende bakterier og 3D-rekonstruksjon av bakterieposisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Seriell to-foton (STP) tomografioppsett. (A) Tomograf som inkluderer (B) 2-fotonavbildning med (C) automatisert seriell vevsseksjon. (D) Innsamlede vevsskiver for oppfølgingsundersøkelser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Flissøm og belysningskorreksjon. Fliser sys og ujevn belysning korrigeres for bruk av korrigerte intensitetsfordelinger ved bruk av regulert energiminimering (CIDRE). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Segmentering av Salmonella som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP) ved hjelp av en støttevektormaskin (SVM) og et konvolusjonelt nevralt nettverk (CNN). (A) Representative bilder av GFP-objekter segmentert etter SVM (venstre) og tilsvarende bilder (høyre) med områder segmentert etter SVM (Skalalinje: 10 μm). (B) Grupperte rød-grønn-blå (RGB) verdifordeling for de segmenterte områdene. (C) Representative bilder av ikke-GFP-objekter feilaktig identifisert av SVM som bakterier (venstre). CNN avfeier dem korrekt som bakgrunn (høyre, skalalinje: 10 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påvisning av Salmonella som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP) ved tomografi og bekreftelse ved immunhistokjemi. Bilder av samme seksjon tatt ved tomografi (venstre) eller konfokalmikroskopi etter farging med et antistoff mot Salmonella lipopolysakkarid (høyre). Nøytrofiler (røde) ble farget ved in vivo-injeksjon av et PE-merket anti-Ly-6G-antistoff før perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: 3D-rekonstruksjon og lokalisering av Salmonella i infisert musemilt. (A) Tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av en 5 mm tykk miltskive og farget in vivo før perfusjon med anti-CD169-antistoff (rødt). Det blå signalet representerer kollagen oppdaget av andre harmoniske. (B) Ett optisk plan av 3D-stabelen vist i (A). Posisjonene til Salmonella-celler eller mikrokolonier er indikert med stjerner. (C) 3D-rekonstruksjon av Salmonella-posisjoner (stjerner) i infisert lever. Arteriene er synlige basert på kollagenskjedene (blå). Målestokk: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Den lokale vevskonteksten til bakterielle patogener er avgjørende for å bestemme lokale vertsangrep, bakterielle tilpasninger, det lokale utfallet av vertspatogeninteraksjonene og antimikrobiell kjemoterapi, og de individuelle bidragene til det totale sykdomsutfallet. Å avbilde mikrometerstore bakterier i centimeterstore organer har vært utfordrende. Seriell to-foton (STP) tomografi gir tilstrekkelig romlig oppløsning til å oppdage individuelle bakterieceller i hele organer, automatisert snitting og avbildning, og tilstrekkelig gjennomstrømning (~1 organ per dag)11. Mens vertsantigener kan farges in vivo, bør patogenceller uttrykke egnede fluorescerende proteiner for å sikre omfattende påvisning av intracellulære patogenceller. De resulterende datasettene (0,5-1,5 TeraByte per organ) utgjør betydelige utfordringer for IT-infrastrukturer for dataanalyse og lagring.
Det er flere kritiske trinn i denne metoden. For det første kreves en patogenstamme med påviselig og homogen ekspresjon av fluorescerende protein GFP eller YFP. Ideelt sett brukes en kromosomekspresjonskassett25 for å minimere fluorescensheterogenitet på grunn av variasjon i plasmidkopinummer. Tilstrekkelig fluorescensintensitet er nødvendig, men for høye nivåer av fluorescerende protein bør unngås for å unngå kondisjonssvikt av patogenet23. Passende ekspresjonsnivåer kan oppnås ved valg av en passende promotor og finjustering av det ribosomale bindingsstedet25 eller hele 5' uoversatt region (UTR)26. For det andre bør perfusjonsfikseringen involvere en innledende vask med buffer for å fjerne så mange erytrocytter som mulig fra blodsirkulasjonen. Dette er spesielt kritisk for milt og lever (selv om fullstendig fjerning av erytrocytter fra disse organene er vanskelig). Gjenværende erytrocytter absorberer lys i den synlige delen av spekteret og kompromitterer bildekvaliteten27. For det tredje er lagring av det faste vevet i kryobeskyttelsesmidlet avgjørende for å redusere vevsautofluorescens, som er spesielt høy i betente vev og kan overskygge den relativt svake fluorescensen til patogencellene11. For det fjerde er den effektive tverrbindingen av vevet til den omkringliggende agaroseblokken avgjørende for jevn vibratomskjæring uten at vevet hopper ut av agaroseblokken. For det femte må fluorescerende signaler og deres identifikasjon som patogenceller verifiseres uavhengig ved hjelp av ortogonale tilnærminger som farging med antistoffer mot patogenkomponenter (som lipopolysakkarid for gramnegative bakterier) og konfokalmikroskopi av snittene hentet fra tomografen11. Noen infiserte vev inneholder autofluorescerende partikler med lignende form og overlappende fluorescensspektre som lett kan feiltolkes som patogenceller. For det sjette bør mengden patogenceller i mikrokolonier sammenlignes med ortogonale tilnærminger som konfokalmikroskopi for å vurdere nøyaktigheten. De totale bakteriebelastningene basert på disse beregningene bør verifiseres ved sammenligning med ortogonale tilnærminger som flowcytometri og plating.
Viktige modifikasjoner av den mye brukte STP-protokollen inkluderer å plassere et smalt båndpassfilter 510/20 nm foran fotomultiplikator 211, for å redusere interferens av grønn-gul autofluorescens som er spesielt sterk i infisert og betent lever, milt og Peyers flekker. Den sterke autofluorescensen og den økte lysspredningen av slike organer sammenlignet med hjernen (som dominerer andre anvendelser av STP) genererer også et behov for mer effektiv korreksjon for ujevn belysning. Som en annen modifikasjon bruker denne protokollen CIDRE-tilnærmingen22 for dette formålet (figur 3) og AI-basert segmentering av bakterier. Til slutt ble vevsforbehandling endret ved å inkludere et inkubasjonstrinn i kryobeskyttelsesmiddel ved -20 °C som reduserer vevsautofluorescens og dermed letter påvisning av små patogenceller med relativt svak fluorescens11.
Feilsøking kan være nødvendig hvis ingen patogensignaler kan oppdages, eller segmentering gir utilstrekkelig følsomhet (for mange patogenceller blir savnet) eller utilstrekkelig presisjon (for mange bakgrunnspartikler er segmentert som patogenceller). Hvis autofluorescens i bakgrunnsvev kan påvises, men det er for få patogensignaler, kan patogenene inneholde utilstrekkelige mengder fluorescerende proteiner. Dette kan testes ved hjelp av konfokalmikroskopi av vevssnitt fra samme infiserte vev eller flowcytometri av vevshomogenater19,28. Underliggende årsaker kan være utilstrekkelige ekspresjonsnivåer eller ustabilitet i ekspresjonskassetten. Avbøtende strategier kan inkludere alternative promotorer for å drive ekspresjon, kodontilpasning av genene som koder for det fluorescerende proteinet for patogenarten, bruk av episomale konstruksjoner med høyere kopitall, eller stabilisering av ekspresjonskassetter ved kromosomintegrasjon eller balansert-dødelig komplementering29. Valget av fluorescerende protein er også viktig, men deteksjon er mulig med GFP.mut2, mWasabi, YPet og TIMERbac. Hvis segmenteringen er unøyaktig, kan dette være forårsaket av for svak patogenfluorescens som kan adresseres som beskrevet ovenfor, eller for høy vevsautofluorescensbakgrunn. Omfattende perfusjon av vaskeløsning eller langvarig inkubasjon i lagringsbuffer umiddelbart før innstøping i agaroseblokken og tomografi kan løse disse problemene. Til slutt kreves tilstrekkelig trening av det nevrale nettverket for presis klassifisering, men overdreven trening kan føre til overtilpasning som svekker ytelsen for nye prøver.
Foreløpig kan ingen annen metode avbilde hele organer med tilstrekkelig romlig oppløsning i 3D for å oppdage individuelle bakterier. Fremtidige forbedringer innen vevsrensing og lysarkmikroskopi kan oppnå lignende oppløsning. Dette kan muliggjøre bildebehandling med høyere hastighet og med mer fluorescerende kanaler.
En viktig begrensning ved STP er pikseloppløsningen i planet på ~0,5 μm og vertikal oppløsning på 5 til 10 μm, som er utilstrekkelig for å løse tett lokaliserte bakterier, for eksempel i en tettpakket mikrokoloni. Det er imidlertid mulig å hente ut vevssnitt etter tomografi for sekundær høyoppløselig konfokalmikroskopi av utvalgte vevsdeler. En annen begrensning ved STP er tilgjengeligheten av bare tre fluorescenskanaler, noe som begrenser antall fluoroforer som kan avbildes samtidig. Igjen kan sekundær analyse av hentede vevssnitt med multipleksingsmetoder avsløre plasseringen og intensiteten til mange flere markører for utvalgte vevsdeler. Denne informasjonen kan integreres i den generelle 3D-strukturen til det omkringliggende vevet som bestemt med STP.
Avslutningsvis muliggjør denne protokollen detaljerte undersøkelser av vert-patogen-interaksjoner på lokalt og helorgannivå. Protokollen skal være lett å tilpasse til andre patogener (forutsatt at de kan fås som fluorescerende stammer), andre organer og forskjellige vertsarter.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 og NCCR_ 180541 AntiResist (til DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
- Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
- Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M.
- Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
- Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
- Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
- Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
- Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
- Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
- Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
- Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
- Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
- Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
- Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
- Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).
