Summary
Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.
Abstract
Enfeksiyonların çoğu, karmaşık anatomiye ve lokal olarak değişen konak fizyolojisine sahip üç boyutlu konak dokularında gerçekleşir. Patojen hücrelerin bu farklı ortamdaki konumu, stres seviyelerini, tepkilerini, kaderlerini ve hastalığın genel ilerlemesine ve tedavi başarısızlığına katkılarını önemli ölçüde etkiler. Bununla birlikte, μm boyutundaki patojen hücrelerin cm boyutundaki konakçı organlar içinde bulunmasındaki teknik zorluklar nedeniyle, bu araştırma alanı nispeten keşfedilmemiştir. Burada, bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yöntem sunuyoruz. Enfekte farelerin tüm dalak, karaciğer lobları ve tüm lenf düğümleri boyunca tek tek Salmonella hücrelerini bulmak için seri iki fotonlu tomografi ve yapay zeka ile geliştirilmiş görüntü analizi kullanıyoruz. Floresan raportörler ve in vivo antikor uygulaması kullanılarak, tek Salmonella hücrelerinin replikasyon hızı, spesifik bağışıklık hücreleri ile lokal etkileşimleri ve antibiyotiklere bakteriyel yanıtlar belirlenebilir. Bu metodolojiler, üç boyutlu doku bağlamında enfeksiyonların kapsamlı bir şekilde incelenmesi, önlenmesi ve tedavisi için yollar açar.
Introduction
Enfeksiyonlar, karmaşık anatomiye ve bölümlere ayrılmış fizyolojiye sahip dokularda meydana gelir. Enfekte dokuda bir arada bulunan çeşitli mikro ortamlar, yerel patojen alt kümelerinin kaderini ve bunların genel hastalık sonucuna katkılarını belirleyebilir 1,2,3. Bununla birlikte, cm boyutundaki dokulardaki mikrobiyal patojenlerin kapsamlı 3D haritalaması zorlu olmaya devam etmektedir4. Beynin ve diğer organların görüntülenmesi, sürekli gelişen deneysel stratejilere sahip oldukça aktif bir araştırma alanıdır5, ancak birçok yöntem hala μm boyutundaki bakteriyel patojenleri güvenle tanımlamak için gerekli olan μm altı çözünürlükten yoksundur. Buna karşılık, seri iki foton (STP) tomografi6, tüm dokuların μm altı düzlem içi çözünürlükle otomatik çok renkli, deformasyonsuz görüntülemesini sağlayarak tam hacimsel veri kümeleri verir. Bu yöntem, bir vibratom kullanılarak dokunun tekrarlanan fiziksel kesitini, ortaya çıkan blok yüzlerinin kızılötesi ışıkla aralıklı iki fotonlu görüntülemesi ile birleştirir. STP tomografisi, bağlantı haritaları oluşturmak için beyindeki ince aksonları haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır 7,8,9,10.
STP tomografisi ayrıca bir tomografi kullanarak tüm enfekte dokulardaki11,12 bireysel mikrobiyal patojen hücrelerinin (Salmonella, Toxoplasma) 3D haritalanmasını sağlar. İkinci harmonik jenerasyon, arterlerin etrafında ve dalak trabekülleri gibi fibröz bantlarda kollajen kılıfları ortaya çıkarır ve böylece anatomik bağlam sağlar. İn vivo enjekte edilen floresan antikorlar, tek tek patojen hücreleri ile nötrofiller gibi sızan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmak için konakçı hücreleri boyamak için kullanılabilir. Burada, dokunun işlenmesini, görüntülenmesini, aydınlatma düzeltmesi ile görüntüleme karolarının dikilmesini, görüntülerin üç boyutlu olarak istiflenmesini ve makine öğrenimi araçlarını kullanarak segmentasyonu içeren boru hattı açıklanmaktadır. Bu boru hattı, konakçı bağlamları içinde tek tek patojenlerin, hücrelerin ve mikro kolonilerin 3B konumlarını verir. Mikrokoloniler içindeki tek tek hücrelerin sayısını saymak, çözünürlük sınırları nedeniyle zor olmaya devam etmektedir, ancak bu sayılar, mikrokoloninin entegre parlaklığına dayalı olarak tahmin edilebilir. Rekombinant GFP veya YFP eksprese eden patojenler mevcutsa, boru hattı diğer enfeksiyon modellerine kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri yetkililer tarafından onaylanmıştır (lisans 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) ve yerel yönergelere (Tierschutz-Verordnung, Basel) ve İsviçre hayvan koruma yasasına (Tierschutz-Gesetz) uygundur.
1. Enfekte dokuların hazırlanması ve saklanması
- Tercih ettiğiniz bir enfeksiyon modeli kullanın. Burada, her iki cinsiyetten 10 ila 16 haftalık fareler, intravenöz enjeksiyon ile ~ 1.000 koloni oluşturan birim (CFU) veya yuvarlak uçlu bir iğne ile intragastrik uygulama ile 5 x 107 CFU ile enfekte edilir. Uygun fare türleri arasında BALB/c ve C57BL/6 bulunur.
NOT: Aynı yaklaşım diğer konukçu türler için de kolayca uyarlanabilir. - Boyanmamış dokuda tanımlamayı sağlamak için patojenlerin floresan proteinleri eksprese ettiğinden emin olun. GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 veya mWasabi16 eksprese eden patojenlerin tümü 940 nm uyarma17 kullanılarak görselleştirilebilir. Akış sitometrisi19 ile kolayca tespit edilebilen seviyelerde mCherry18 eksprese eden Salmonella, 800 nm uyarma kullanılarak görüntülenebilir, ancak enfekte dalak ve karaciğerde önemli otofloresan gösteren zayıf sinyal-arka plan oranlarına sahiptir.
- Akış sitometrisi ile kantifikasyona dayalı olarak nötr pH'ta paraformaldehit ile fiksasyondan sonra tüm floresan proteinlerin floresan yoğunluklarının %>70'ini koruduğundan emin olun. Burada enfekte fare dokusu, yani dalak, karaciğer, lenf düğümleri ve Peyer yamaları kullanılır.
- Perfüzyondan 10 dakika önce fikoeritrin (PE) etiketli antikorları enjekte ederek konak hücre yüzey belirteçlerini in vivo olarak boyayın. Nötrofilleri boyamak için, 100 μL PBS'de intravenöz olarak 4 μg anti-Ly-6G-PE enjekte edin. Dalaktaki marjinal zon makrofajlarını boyamak için, 100 μL PBS'ye 4 μg anti-CD169-PE enjekte edin (bkz.
- Enfekte dokuları standart transkardiyal perfüzyon20 ile 15 mL buz gibi soğuk 50 mM fosfat tamponu (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7.4) ile sabitleyin, ardından PB'de 35 mL% 4 paraformaldehit (PFA; fiksatif) (Şekil 1A).
- Kısaca, enfekte hayvana 100 mg / kg ketamin ve 16 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile derin anestezi uygulayın. Ayak parmağını kıstırma refleksinin kaybını onaylayarak uygun anesteziyi sağlayın.
- Kürkü% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin, steril bir kağıt havluyla kurulayın ve göğsü cımbız ve makasla cerrahi olarak açın. Kalbin sol ventrikülüne steril bir iğne yerleştirin, sağ atriyumu steril makasla açın ve ilk tamponu ve ardından sabitleyiciyi bir pompa kullanarak iğne, sol ventrikül ve tüm vasküler sistemden geçirin. Bu, tüm dokuları hızlı ve düzgün bir şekilde sabitler ve ötenaziye neden olur.
- Perfüzyondan sonra dokuyu toplayın, PB tamponunda 20x hacimde% 4 soğuk paraformaldehit içinde inkübe edin ve gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin (Şekil 1B). 0,05 ila 2cm3 boyut aralığındaki dokular için görüntüleme mümkündür. Daha büyük dokular için uygun parçalar halinde kesin.
- Ertesi gün, PFA'yı çıkarmak için dokuyu 3 kez 10 dakika boyunca PB tamponu ile oda sıcaklığında 40 rpm'de çalkalayarak yıkayın.
NOT: PFA toksisitesi nedeniyle, bu adımlar bir çeker ocak içinde gerçekleştirilmelidir. PFA atıklarını kurumsal yönergelere göre atın. - Fazla PB tamponunu çıkarın ve 20x hacimde kriyoprotektan depolama tamponu21 (876 mM sükroz, 0.25 mM polivinilpirolidon, %40 (h/h) etilen glikol, 50 mM PB tamponunda çözülmüş) numuneye 4 ° C'de 40 rpm'de 6-8 saat çalkalayarak veya dokular dibe çökene kadar ekleyin. Doku otofloresansının etkili bir şekilde azaltılmasını sağlamak için numuneleri en az 3 gün boyunca -20 °C'de inkübe edin11. Numuneler -20 °C'de saklandığında 5 yıla kadar kullanılabilir.
NOT: Dokunun batması, depolama tamponunun dokuya uygun şekilde nüfuz ettiğini gösterir.
2. Örnek gömme
- Bir vibratom ile düzgün kesim için dokuyu bir agaroz bloğuna gömün. agarozu periodat ile oksidasyon yoluyla kimyasal olarak önceden aktive edin ve daha sonra kesme işlemi sırasında daha iyi stabilite için doku ile çapraz bağ oluşturmak üzere borohidrit ile azaltın. Aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin.
- 2.25 g agaroz ağırlığında% 4 oksitlenmiş agaroz hazırlayın ve 0.21 g NaIO4 ekleyin. Agaroz ve NaIO4'e 100 mL PB ekleyin. Işıktan koruyarak 2-3 saat davlumbazda oda sıcaklığında karıştırın.
NOT: Kritik adım: Karıştırmayı 3 saatten fazla aşmayın, aksi takdirde agaroz zayıf bir şekilde polimerize olur. - Agarozu, 0,2 μm membranlı standart bir vakum filtresinde membran filtrasyonu ile geri kazanın. Kalan NaIO4'ü 3x'i 50 mL PB tamponu ile yıkayarak çıkarın. Oksitlenmiş agarozu 50 mL PB tamponunda yeniden süspanse edin.
NOT: Bu aşamada agarozu eritmeyin. Agaroz 4 °C'de 2-3 haftaya kadar ışıktan korunarak saklanabilir. - 1 L suya 19 g boraks ve 3 g borik asit ekleyerek borohidrür çözeltisi hazırlayın. Eriyene kadar karıştırın ve pH'ı 1 M NaOH ile 9-9,5'e ayarlayın. Çeker ocaktaki bir karıştırma plakasında 100 mL borat tamponunu 40 °C'ye ısıtın. 0,2 g NaBH4 ekleyin ve ışıktan koruyarak 15-30 dakika karıştırın.
NOT: Borohidrür çözeltisi karanlıkta oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilir. Kritik adım: Borat tamponuna NaBH4 eklenirken gaz oluşacaktır, bu nedenle bu adımı bir çeker ocak içinde gerçekleştirin. Patlamaya neden olabileceğinden bu adımı sıkıca kapatılmış bir kapta yapmayın. - Azaltılmış otofloresan (≥ 3 gün) için yeterli inkübasyondan sonra dondurucudan doku alın, fazla kriyoprotektan depolama tamponunu çıkarın ve dokuyu oda sıcaklığında (RT) 40 rpm'de çalkalayarak PB tamponu ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Yaklaşık 20 mL oksitlenmiş agaroz süspansiyonunu (adım 1'de hazırlanır) bir mikrodalgada (~30 s için 700 W) eritin, işleyecek kadar soğumasını bekleyin (~ 45 ° C) ve plastik bir kalıba dökün.
NOT: Kritik adım: Agarozu numune üzerindeki mikrodalgada ısıttıktan hemen sonra eklemeyin, bu dokunun tahrip olmasına neden olabilir. - Dokuyu nazikçe almak için bir cımbız kullanın ve hızlı bir şekilde agarozun alt ortasına yerleştirin. Agarozun polimerize olmasına izin vermek için kalıbı RT'de 15 dakika inkübe edin.
- Agaroz polimerizasyonunu takiben, plastik kalıbı dört köşesinden bir neşter ile açın ve agaroz küpünü eldivenli parmaklarla dikkatlice alın.
- Oksitlenmiş agaroz ve dokunun çapraz bağlanmasını başlatmak için numuneyi 4 ° C'de 2-3 saat boyunca borohidrür çözeltisine (adım 2'de hazırlanır) daldırın. Bu, kesit alma sırasında dokunun ayrılmasını önler.
NOT: Kritik adım: Borohidrür içine daldırılmış numune, 4 °C'de ışıktan korunarak inkübe edilmelidir. - Agaroz küpünü PB tamponu 2x ile 10 dakika yıkayın. Agaroz küpünü, doku üst tarafta olacak şekilde çevirin ve bloğu birkaç damla anında yapıştırıcı kullanarak manyetik bir slayta (arkaya iki mıknatıs takılı mikroskop slaytı) tutturun. Yapıştırıcının katılaşması 10-20 dakika sürer, bu nedenle agarozun üzerine PB tamponu damlaları içeren bir kağıt mendil yerleştirin ve numunenin baştan sona yeterince nemli kalmasını sağlayın (Şekil 1C).
3. Mikrotomun hazırlanması ve sahnenin hazırlanması
- Manyetik slaytı, tomografinin numune kutusunun ortasındaki metalin üzerine yerleştirin.
- Kutuyu PB tamponu ile doldurun ve dikkatlice sahneye yerleştirin ve numune kutusunu tomografi tablasına sabitlemek için soldaki vidayı sıkın.
NOT: Vidaları aşırı sıkmayın, aksi takdirde plastik kutuya zarar verir. - Bıçağı mikrotomun üzerine yerleştirin ve numunenin konumunu dikkatlice mikrotomun yakınına ve altına kaydırın. Agarozun üst yüzeyi, mikrotomun bıçağı ile aynı seviyede olmalıdır.
NOT: Çok alçakta konumlandırmak kesme süresini boşa harcarken, çok yükseğe yerleştirmek ilk kesimde bloğun büyük bir kısmını kaldıracaktır. - agaroz küpünü hedefin merkezine konumlandırmak için sahneyi hareket ettirin ve tüm agaroz küpünün sağlam bir dilimini elde edene kadar tomografi yazılımındaki Dilim düğmesine art arda tıklayın.
4. Yüzeyin tahsisi ve 2D görüntülerin elde edilmesi
- Objektif lensi doku örneği üzerinde x ve y yönlerinde ortalayın.
- Lazer yazılımını açın ve yazılımdaki lazeri açın. Bir tıkırtı sesi duyduğunuzda lazer anahtarını açın ve dalga boyunu 800 nm'ye ayarlayın.
NOT: Görüntülemeden önce lazer kaynağının en az 30 dakika, ideal olarak 1 saat ısıtılması gerekir. - Mikroskobun kabin kapılarını kapatın, odadaki tüm ışık kaynaklarını kapatın ve PMT'leri açın ve voltajı 750 V'a ayarlayın.
NOT: Kritik adım: PMT'ler ışığa karşı çok hassastır, dolap kapıları kapatılmadıkça ve odadaki tüm ışık kaynakları kapatılmadıkça ışığı kapalı tutun. - Tomografi yazılımının protokol ayarlarını belirtildiği gibi ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü otomatik olarak ayarlayın ve voltajı V20 ve V3 için sırasıyla 1 ve 2'e ayarlayın.
- Örneğin bir fotoğrafını çekmek için tomografi yazılımındaki 2D düğmesine tıklayın.
- Görünür otofloresanslı bir görüntü göründüğünde, agaroz küp yüzeyindeki odak düzlemini ayarlamak için z-piezo'yu ayarlayın. İlk tarama, numunenin sabit bir görüntüsünü elde etmek için yüzeyin 20 μm altında olacaktır.
- Otofloresan arka planı görünmüyorsa, bir sinyal görünene kadar kontrastı artırın. Görünür bir sinyal olmadığı ortaya çıkabilir (yani, dokunun üstündeki agaroz nedeniyle). Bu durumda, z-piezo cihazını kullanarak z-eksenini agaroz yüzeyine ulaşana kadar ayarlayın. İstenen konum z-piezo cihazının menzili dışındaysa, lensin manuel olarak hareket ettirilmesi gerekebilir.
- Numunenin yüzeyini bulduktan sonra birden fazla 50 μm'lik dilim kesin ve odak düzleminin blok yüzey yüzeyine düzgün bir şekilde ayarlandığından emin olmak için her kesimden sonra 2D görüntüler elde edin.
5. Numunelerin kenarlarının bulunması ve lazerin başlangıç noktasına ayarlanması
- Lazer tarama alanının xy koordinatlarına (4 köşe koordinatı) dayanarak, çevredeki agaroz bloğunun minimal görüntülemesi ile görüntüleme alanını doku ile sınırlayın.
- PMT'leri kapatın, lazer dalga boyunu 800 nm'ye ayarlayın, lazer deklanşörünü açmak için değiştirin. Agaroz bloğuna giren lazer ışığının konumu, dağınık ışıktan oluşan kırmızı bir nokta olarak görülebilir (Şekil 2A,B).
Kritik adım: Sınıf 4 lazere özellikle dikkat edin. İnsan dokularına ve gözlerine hızla zarar verebilir. Personelin böyle bir cihazı güvenli bir şekilde çalıştırması için özel eğitime ihtiyacı vardır. - Geri, sağ, ön ve sol sırayı kullanarak doku kenarlarının koordinatlarını bulmak için sahneyi kaydırırken lazer noktasını kullanın.
- Koordinatları iki kez kontrol edin ve lazer noktasını, dokuyu görüntülemek için varsayılan başlangıç noktası olan sağ ön köşeye yerleştirin.
- Konsol penceresindeki koordinatları, xy adımlarıyla tanımlanan, makine tarafından tanınabilir blok boyutlarına dönüştürün. Bu adım ölçümlerini yazılımın protokolüne girin. Dolap kapaklarını kapatın.
6. 3D tarama / kesit alma
- GFP, mWasabi veya YPet ve PE'yi uyarmak için dalga boyunu 940 nm'ye değiştirin.
NOT: Lazer bu dalga boyunda insan gözüyle görülemez. GFP, mWasabi ve TIMERbac'ın yeşil yayan bileşeni için sinyalden arka plana gelişmek için, PMT 510'nin önüne 20/2 nm'lik dar bir bant geçiren filtre koyun. Bu, yeşil-sarı doku otofloresansının neden olduğu paraziti azaltır. - Mikroskop deklanşörünü otomatik moda ve deklanşör voltajı ayarlarını V20 için 1 ve V1.71 için 2'e getirin.
- Yazılımda aşağıdaki üç parametreyi ayarlayın: Kesit kalınlığı- çoğu amaç için 50 μm'ye ayarlayın. Karaciğer için, sınırlı görüntüleme derinliği nedeniyle 30 μm'ye ayarlayın. Fiziksel bölümlerin sayısı- bu, görüntülenecek toplam doku derinliğini belirler ve buna göre ayarlanır. Her bölüm için yakalanacak uçak sayısı - bu, z çözünürlüğünü belirleyecektir. Çoğu amaç için 5 düzlem (10 μm dikey çözünürlük sağlar) kullanın. Karaciğer için 3 veya daha az düzlem kullanın.
- Lazer kazancını ayarlayın. Bunun farklı dokular ve tarama derinliği için ampirik olarak test edilmesi gerekir.
- Alınan görüntüleri depolamak için klasör yolunu ve adını tanımlayın ve görüntüleme meta dosyası için uygun bilgileri sağlayın.
- Girilen tüm değerleri iki kez kontrol edin.
- Tarama işlemini başlatmak için 3D mozaik ayarına tıklayın (Şekil 1D).
- Görüntüleme tamamlandıktan sonra, doku kesitlerini su tankından dikkatlice toplayın ve daha fazla kullanana kadar -20 °C'de depolama tamponunda saklayın (Şekil 1E; Şekil 2C,D).
7. Görüntü işleme ve veri analizi
- MATLAB komut dosyalarını https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020'dan bir Linux bilgisayara indirin. Komut dosyalarını bir klasöre kopyalayın, örneğin, /home/user/Program/.
NOT: Komut dosyasının tam olarak işlevsel olması için MATLAB ve Fiji (veya ImageJ) için Computer Vision Toolbox eklentisinin Linux bilgisayarlara yüklenmesi gerekir. - Döşeme görüntülerini aşağıda açıklandığı gibi dikin.
- Tomografi sunucusundan Linux bilgisayara veri aktarın.
- StepOneStitchingAndArchive.m MATLAB komut dosyasını açın ve ham verileri içeren kaynak klasörü bulun. Komut dosyasındaki kaynak ve hedef klasörleri tanımlayın.
- Düzenleyici sekmesine geçin ve Çalıştır'a tıklayın. İlerleme bilgisi komut penceresinde görüntülenir. İşleme, Mozaik dosyasından bilgi okumayı, görüntü birleştirmeden önce döşeme indeksi oluşturmayı, Cidre22 (Şekil 3) ile arka plan aydınlatma düzeltmesini ve farklı derinliklerde elde edilen optik katmanlar arasındaki aydınlatma düzeltmesini içerir. Dikişli görüntüleri, kaynak klasördeki stitchedImages_100 adlı bir alt klasörde bulun. tar komutunu kullanarak ham verileri uzun süreli depolama için sıkıştırın ve tar.bz2 dosya adı uzantısıyla tek bir dosya olarak kaydedin (Şekil 1F).
- Destek vektör makinesi ile model eğitimi ve segmentasyon gerçekleştirin. Destek vektör makinesini eğitmek ve segmentasyonu gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.
NOT: Üç floresan kanalının her biri için dikişli görüntüler, stitchedImages_100'nin 3 alt klasöründe (kırmızı, turuncu ve yeşil floresansa karşılık gelen 1, 2 ve 3 adlı) saklanır. Her alt klasör, aynı kanaldan eklenen tüm görüntüleri içerir.- Dikişli görüntüleri önizleyin. Fiji (veya ImageJ) ile her alt klasörden aynı dosya adına sahip bir görüntü açın. Üç kanalı tek bir renkli görüntüde birleştirin. Bakteri ve doku otofloresansından net sinyaller görene kadar her kanalın parlaklığını ayarlayın. Bir sonraki adım için her kanalın ayarlanan maksimum yoğunluk seviyesini not edin.
- StepTwoSegmentationAndAnalysis.m MATLAB betiğini açın ve kaynağa göz atın. Eğitim için kaynak klasörü ve görüntü adlarını tanımlayın. Mesela
sourceD = '/' ;
red_name = [kaynakD '1/section_020_01.tif']; green_name = [kaynakD '2/section_020_01.tif'];
blue_name = [kaynakD '3/section_020_01.tif']; - Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'a tıklayın.
- Renk eşiklerini soran bir iletişim kutusu görünecektir, Fiji ile önceki manuel kontrole göre doldurun (adım 7.3.1).
- İletişim kutularına göre arka plan bölgelerini ve ilgi alanlarını (yani bakteriler) seçin. Modelin ne kadar iyi eğitildiğini gösteren ve daha fazla bölge eklenmesi gerekip gerekmediğini soran grafikler görünecektir. Bakteriler net bir şekilde bölümlere ayrılana kadar daha fazla ilgi alanı ve arka plan ekleyin (Şekil 4A,B).
- Modeli adlandırın ve kaydedin. Komut dosyası görüntüleri otomatik olarak yükleyecek ve bir medyan filtre (yarıçap 2 piksel) uygulayacaktır.
- Segmentasyon işlemi otomatik olarak çalışır ve ilerleme bilgileri komut penceresinde gösterilir. Segmentasyonun ilerlemesini izleyin. Segmentasyon, diğer dikişli görüntülerde modelle iyi çalışmıyorsa, daha fazla arka plan ve bakteri bölgesi eklemek için model eğitimini tekrarlayın.
- Segmentasyonun sonuçlarını görmek için Allpositions_filter3D.txt adlı dosyayı kontrol edin. Bu dosya, her bakteri veya bakteri mikrokolonisi için ağırlık merkezinin koordinatlarını ve karşılık gelen entegre floresan yoğunluğunu içerir (Şekil 1G).
- Aşağıda açıklandığı gibi evrişimli sinir ağı ile ek yapıtları kaldırın.
NOT: Bazı bakteriler için, Destek Vektör Makinesi ile basit segmentasyon hala bazı görüntüleme artefaktları içerir. Bu özellikle YPet eksprese eden bakteriler için geçerlidir. Sinir ağı tabanlı segmentasyon, bu artefaktları verimli bir şekilde kaldırabilir (Şekil 4C). Komut dosyasının tamamen işlevsel olması için MATLAB ve Fiji (veya ImageJ) için Görüntü İşleme Araç Kutusu eklentisinin Windows bilgisayarlara yüklenmesi gerekir. Altta yatan sinir ağı hakkında daha fazla bilgi için bkz.: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html- Görüntüleri hazırlayın. Fiji kullanarak tif dosyalarını farklı parlaklık ayarlarıyla jpg dosyalarına dönüştürün. Manuel iyileştirme ile en az 600 bakteri ve 600 artefaktı tanımlayın ve bu nesnelerin güvenli kırpılmış görüntülerini uygun klasörlerde bulun.
- CNNtestV4.m MATLAB komut dosyasını açın ve adım 7.4.1'deki nesne görüntülerini içeren kaynak dosyalara göz atın.
- Eğitim için görüntü klasörünü tanımlayın. Mesela
digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
Eğitim için görüntü sayısını tanımlayın, örneğin, numTrainFiles = 600. - Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'a tıklayın. Eğitimden sonra, CNN model dosyası kaynak klasöre gregnet1.mat olarak kaydedilir.
- Test görüntülerini içeren bir klasör tanımlayın. Mesela
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Sonuçlar, görüntü adı ve bakteri veya artefakt olarak sınıflandırma hakkında bilgi içeren bir dosya YourFile.txt kaydedilir. - Test görüntüleri ile klasör tanımlayın. Mesela
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Sonuçlar, görüntü adı ve bakteri veya artefakt olarak sınıflandırma hakkında bilgi içeren bir dosya YourFile.txt kaydedilecektir.
- Aşağıda açıklandığı gibi tek bakterilerin floresan yoğunluğuna dayalı olarak mikro kolonilerin boyutunu tahmin edin.
NOT: Tomografinin uzamsal çözünürlüğü, yoğun şekilde paketlenmiş mikrokoloniler içindeki tek tek bakteri hücrelerini çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, her bir mikrokolonideki bakteri sayısı, tek bir bakterinin floresansına bağlı olarak mikrokoloninin toplam floresansına dayalı olarak tahmin edilebilir. Bu tahmin doğruluğu, bakteri popülasyonu boyunca floresan yoğunluğunun homojenliğine bağlıdır.- Tomografiden alınan kesitlerin immünohistokimyasını kullanarak lipopolisakkarit gibi bakteriyel bileşenleri boyayarak STP tomografisindeki GFP pozitif olayların kimliğini doğrulayın (Şekil 1H; Şekil 5).
- En az 30 tek bakteriyi tanımlayın ve ilgili segmentasyon sonuçlarından floresan yoğunluklarını alın. Medyan yoğunluk değerini tek bir bakteri için referans olarak kullanın. Mikrokoloninin toplam floresan yoğunluğunu tek bir bakteri için referans değere bölerek her bir mikrokoloninin bakteri sayısını hesaplayın (Şekil 1I).
- Aşağıda açıklandığı gibi görselleştirme yazılımı ile 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
- Görüntü hazırlama
- Doku kapsülleri, arterler ve trabeküller dahil olmak üzere yararlı bir anatomik referans sağlayan ikinci harmonik kollajen sinyallerini içeren mavi kanal görüntülerini alın. 2. kanal olarak bakteriler için bölümlere ayrılmış görüntüleri kullanın.
- 1. kanaldaki görüntüleri hem x hem de y eksenlerinde 10 kat depolayın ve küçültülmüş görüntüleri yeni bir klasöre kaydedin. Aynı klasör içinde küçültülmüş görüntülerin 3 kopyasını oluşturun. Yeni çoğaltmaların adı aynı sırayı korumalıdır. Örneğin: section_001_01.tif, 1'i section_001_01-copy.tif adıyla çoğaltın, section_001_01-copy-copy.tif. Bu adımları 2. kanaldaki görüntülere de uygulayın. Küçültme, daha yönetilebilir dosya boyutları sağlar. Üçlü görüntüler z eksenini yumuşatacaktır.
- Fiji ile görüntü yığınları oluşturmak için her kanaldaki görüntüleri birleştirin. Görüntü > Yığınlar > Araçlar > Yığın sıralayıcı > Etiketlere göre sırala'yı tıklayın.
- 3D filtreleme gerçekleştirin. 3D filtre > Filtreler > İşle'ye tıklayın ve Z filtresi boyutunu 6 olarak ayarlayın. Görüntü yığınlarını kaydedin.
- Aşağıda açıklandığı gibi 3B görselleştirme gerçekleştirin.
- Görselleştirme yazılım paketini Arena görünümünde açın (varsayılan ayar). Arena görünümüne klasör eklemek için İzleme klasörü simgesini kullanın. *.ims veya *.tif dosyasını açmak için çift tıklayın (7.6.1'de hazırlanmıştır).
- Edit>Image Properties'i (Görüntü Düzenleme) kullanarak, Display Adjustment (Görüntü Ayarlama) penceresindeki farklı kanalların renk temsillerini (LUT'ler) ayarlayın.
- Min/maks değerlerini ve gama düzeltmesi için bir değeri manuel olarak ayarlamak için Gelişmiş'e tıklayın.
Adları ve LUT'ları değiştirmek için Kanal adlarına tıklayın. - Görüntünün görünümünü ayarladıktan sonra, Anlık Görüntü aracını kullanarak geçerli görünümü dışa aktarın.
- 3D verileri bir film olarak göstermek için Animasyon simgesini kullanın. Bir perspektif/görünüm bulmak için Gezinti İşaretçisi'ni kullanın ve yakınlaştırın ve ana kareler eklemek için + Ekle'yi kullanın. Başka bir konuma gidin ve sonraki ana kareyi ekleyin. Filmi oluşturmak için Kırmızı kayıt düğmesine basın. İstediğiniz hedef klasöre ve dosya türüne kaydedin (Şekil 1J).
- Görüntü hazırlama
Representative Results
Açıklanan prosedür, dalak, karaciğer, mezenterik lenf düğümleri ve Peyer yamaları11 gibi tüm fare organlarında bireysel Salmonella hücrelerinin tespit edilmesini sağlar (Şekil 5 ve Şekil 6). Ayrıca fare beynindeki Toxoplasma gondii parazitlerini de tespit eder12. Karaciğer, Peyer yamaları ve dalak dahil olmak üzere bazı enfekte dokular yeşil-sarı aralıkta önemli miktarda otofloresan yayar. Otofloresan, doku yapısını korumak için gerekli olan paraformaldehit ile fiksasyon ile daha da arttırılır. Bu otofloresan arka plana karşı GFP, mWasabi ve TIMERbac'ın yeşil bileşeninden yeşil floresansın algılanması, fotoçoğaltıcı 2'nin (yeşil emisyonları toplayan) önüne 510/20 nm'lik dar bir bant geçiren filtre (çoğu GFP emisyonunu iletir ancak otofloresan spektrumunun büyük bir bölümünü bloke eder) ve sabit dokuları kriyoprotektan11'de 3 veya daha fazla gün depolayarak doku otofloresansını azaltarak iyileştirilir. Bununla birlikte, bakteriler yine de GFP veya diğer floresan proteinlerin hücre başına en az birkaç bin kopyasını ifade etmelidir. Öte yandan, zayıflatılmış virülansa yol açabilecek fitness maliyetlerini en aza indirmek için aşırı floresan protein seviyelerinden kaçınılmalıdır23.
Dokulardaki floresan bakterilerin doğru segmentasyonu, görüntüleme sonrası elde edilen doku kesitlerinin immünohistokimyası ile doğrulanabilir. Spesifik olarak, lipopolisakkarit gibi bakteriyel yüzey bileşenlerine karşı bir antikorla boyanan nesneler, STP tomografisi ile elde edilen floresan görüntüsü ile hizalanabilir (Şekil 5). Bazı lekeli Salmonella hücrelerinin floresan proteinlerden yoksun olduğunu ve bu nedenle hem konfokal mikroskopide hem de STP tomografisinde saptanabilir floresan olduğunu not etmek önemlidir. Bu hücreler, tek sıralanmış hücrelerden akış sitometrik sıralama ve büyüme kültürlerinin yanı sıra agar plakalarındaki koloni oluşturan birimlerin sayısı ile akış sitometrisi24 ile belirlenen floresan Salmonella hücrelerinin sayısı arasındaki yakın korelasyon ile gösterildiği gibi, konakçı bağışıklık sistemi tarafından öldürülen Salmonella'dır. Ek olarak, plazmit kaybı, floresan olmayan canlı hücrelere neden olabilir ve bunun, plazmit üzerindeki seçim markörüne karşılık gelen uygun antibiyotikli ve uygun antibiyotikler olmadan ortam üzerine kaplanarak test edilmesi gerekir. pSC101'den türetilen plazmitler için in vivo plazmit kaybı nadirdir19. 11'de kullanılan sifB::gfp gibi kromozomal olarak entegre ekspresyon kasetlerinin çoğu için, ekspresyon kaybı in vivo olarak tespit edilemez. Segmentasyon immünohistokimya verileriyle tutarsızsa, segmentasyon hattının değiştirilmesi gerekir.
STP tomografinin çözünürlüğü, yoğun paketlenmiş mikrokoloniler içindeki tek tek bakteri hücrelerini çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, mikrokoloninin toplam floresan yoğunluğu, Salmonella hücrelerinin sayısının tahmin edilmesini sağlar. Bu, Salmonella sifB::gfp11 gibi oldukça homojen floresan seviyelerine sahip bir floresan suşu gerektirir. Tüm mikrokoloniler ve tek hücreler için tahmini Salmonella hücre sayısını birleştirmek, doku homojenatlarının kaplanması veya akış sitometrisi gibi alternatif yöntemlerle tutarlı olan toplam bakteri doku yüklerini verir11. STP tomografi için perfüzyonla fikse edilmesi gerektiğinden plak ve akım sitometrisi doğrudan aynı dokulardan yapılamaz. Bunun yerine, sabit olmayan ek hayvanlarla yapılması gerekir. Çeşitli yaklaşımlarla belirlenen medyan bakteri yükleri 3 kattan fazla farklılık gösteriyorsa, floresan bakterilerin canlılığı tehlikeye girebilir (daha düşük koloni oluşturan birimler durumunda) veya bazı bakteriler floresan raportör yapısını kaybetmiş olabilir (daha yüksek koloni oluşturan birimler durumunda). Bu tür tutarsızlıkların kaynağını belirlemek için kontrol deneyi gerekecektir.
STP tomografi, enfekte dokuların 3 boyutlu yapısı içinde bakteri hücrelerinin lokalizasyonunu sağlar. Kollajenin ikinci harmonik sinyalleri, arterler ve trabeküller gibi anatomik işaretler sağlar. Ek olarak, konak hücreler, perfüzyondan önce yüzey belirteçlerine bir antikor enjekte edilerek in vivo olarak boyanabilir (Şekil 5 ve Şekil 6). Bu boyama, doku bölmeleri ve iltihap odakları dahil olmak üzere belirli mikro ortamlar için ek işaretler sağlar (hücre içi belirteçler ve dalak beyaz pulpa veya beyin gibi difüzyon bariyerlerine sahip bazı bölmelere kolayca erişilemez, bunun için uygun in vivo boyama). Bu yaklaşım, antimikrobiyal kemoterapi sırasında Salmonella'nın uzun süreli sağkalımını sağlayan bir doku kompartmanı olarak splenik beyaz pulpayı ortaya çıkardı11.
Son olarak, orta veya yavaş oranlarda çoğalan Salmonella, replikasyon hızı11,15 için tek hücreli bir raportör olan timerbac'ı eksprese eden suşlar kullanılarak dokuların 3D yapısı içinde tanımlanabilir ve lokalize edilebilir.
Şekil 1: Seri iki foton (STP) tomografi kullanılarak tüm organ görüntüleme prosedürü. (A-B) Organ, transkardiyal perfüzyondan sonra toplanır ve gece boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde saklanır. (C-E) Organ oksitlenmiş agaroz içine gömülür ve çapraz bağlanır, daha sonra doku taranır ve STP tomografisi kullanılarak dilimlenir. Dilimler daha sonraki immünohistokimya için toplanır. (F-J) Bakteri sayılarının ölçülmesi, floresan bakterilerin doğrulanması ve bakteri konumlarının 3D rekonstrüksiyonu için hesaplamalı analiz boru hatları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Seri iki foton (STP) tomografi kurulumu. (A) (B) 2 fotonlu görüntüleme ile (C) otomatik seri doku kesitini içeren tomografi. (D) Takip araştırmaları için toplanan doku dilimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fayans dikişi ve aydınlatma düzeltmesi. Fayanslar dikilir ve düzensiz aydınlatma, düzenli enerji minimizasyonu (CIDRE) kullanılarak düzeltilmiş yoğunluk dağılımları kullanılarak düzeltilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir Destek Vektör Makinesi (SVM) ve bir Evrişimli Sinir Ağı (CNN) kullanarak yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden Salmonella'nın segmentasyonu. (A) SVM tarafından bölümlere ayrılmış GFP nesnelerinin temsili görüntüleri (solda) ve SVM tarafından bölümlere ayrılmış bölgelere sahip karşılık gelen görüntüler (sağda) (Ölçek çubuğu: 10 μm). (B) Segmentlere ayrılmış bölgeler için kümelenmiş kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerler dağılımı. (C) SVM tarafından yanlış bir şekilde bakteri olarak tanımlanan GFP olmayan nesnelerin temsili görüntüleri (solda). CNN bunları doğru bir şekilde arka plan olarak reddeder (sağda, ölçek çubuğu: 10 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden Salmonella'nın tomografi ile tespiti ve immünohistokimya ile doğrulanması. Salmonella lipopolisakkarit (sağda) antikoru ile boyandıktan sonra tomografi (solda) veya konfokal mikroskopi ile elde edilen aynı bölümün görüntüleri. Nötrofiller (kırmızı), perfüzyondan önce PE etiketli bir anti-Ly-6G antikorunun in vivo enjeksiyonu ile boyandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Enfekte fare dalağında Salmonella'nın 3D rekonstrüksiyonu ve lokalizasyonu. (A) 5 mm kalınlığında bir dalak diliminin üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu ve anti-CD169 antikoru (kırmızı) ile perfüzyondan önce in vivo boyanması. Mavi sinyal, ikinci harmonikler tarafından tespit edilen kolajeni temsil eder. (B) (A)'da gösterilen 3B yığının bir optik düzlemi. Salmonella hücrelerinin veya mikro kolonilerin konumları yıldızlarla gösterilir. (C) Enfekte karaciğerdeki Salmonella pozisyonlarının (yıldızların) 3D rekonstrüksiyonu. Arterler, kollajen kılıflarına (mavi) göre görülebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bakteriyel patojenlerin lokal doku bağlamı, lokal konak saldırılarını, bakteriyel adaptasyonları, konak patojen etkileşimlerinin ve antimikrobiyal kemoterapinin lokal sonuçlarını ve genel hastalık sonucuna bireysel katkıları belirlemek için çok önemlidir. Santimetre boyutundaki organlarda mikrometre boyutundaki bakterilerin görüntülenmesi zor olmuştur. Seri iki fotonlu (STP) tomografi, tüm organlardaki tek tek bakteri hücrelerini tespit etmek için yeterli uzamsal çözünürlük, otomatik kesit alma ve görüntüleme ve yeterli verim (günde ~ 1 organ) sağlar11. Konak antijenleri in vivo olarak boyanabilirken, patojen hücreler, hücre içi patojen hücrelerinin kapsamlı tespitini sağlamak için uygun floresan proteinleri eksprese etmelidir. Ortaya çıkan veri kümeleri (organ başına 0,5-1,5 TeraBayt), veri analizi ve depolaması için BT altyapıları için önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır.
Bu yöntemde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, floresan protein GFP veya YFP'nin saptanabilir ve homojen ekspresyonuna sahip bir patojen suşu gereklidir. İdeal olarak, plazmit kopya sayısı varyasyonuna bağlı floresan heterojenliğini en aza indirmek için bir kromozomal ekspresyon kaseti25 kullanılır. Yeterli floresan yoğunluğu gereklidir, ancak patojenin23 uygunluk bozukluklarını önlemek için aşırı floresan protein seviyelerinden kaçınılmalıdır. Uygun ekspresyon seviyeleri, uygun bir promotörün seçilmesi ve ribozomal bağlanma bölgesinin25 veya tüm 5' çevrilmemiş bölgenin (UTR)26 ince ayarıyla elde edilebilir. İkinci olarak, perfüzyon fiksasyonu, kan dolaşımından mümkün olduğunca çok eritrositi uzaklaştırmak için tampon ile bir ilk yıkamayı içermelidir. Bu özellikle dalak ve karaciğer için kritiktir (bu organlardan eritrositin tamamen çıkarılması zor olsa da). Kalan eritrositler, spektrumun görünür kısmındaki ışığı emerek görüntüleme kalitesini tehlikeye atar27. Üçüncüsü, sabit dokuların kriyoprotektan içinde depolanması, özellikle iltihaplı dokularda yüksek olan ve patojen hücrelerin nispeten zayıf floresansını gölgede bırakabilen doku otofloresansını azaltmak için kritik öneme sahiptir11. Dördüncüsü, dokunun çevredeki agaroz bloğuna etkili bir şekilde çapraz bağlanması, doku agaroz bloğundan dışarı atlamadan düzgün vibratom kesimi için kritik öneme sahiptir. Beşincisi, floresan sinyaller ve bunların patojen hücreler olarak tanımlanması, patojen bileşenlerine karşı antikorlarla boyama (Gram-negatif bakteriler için lipopolisakkarit gibi) ve tomografi11'den alınan kesitlerin konfokal mikroskobu gibi ortogonal yaklaşımlar kullanılarak bağımsız olarak doğrulanmalıdır. Bazı enfekte dokular, patojen hücreler olarak kolayca yanlış yorumlanabilen benzer şekle ve örtüşen floresan spektrumlarına sahip oto-floresan parçacıklar içerir. Altıncısı, mikrokolonilerdeki patojen hücrelerin miktarı, doğruluğu değerlendirmek için konfokal mikroskopi gibi ortogonal yaklaşımlarla karşılaştırılmalıdır. Bu hesaplamalara dayanan genel bakteri yükleri, akış sitometrisi ve kaplama gibi ortogonal yaklaşımlarla karşılaştırılarak doğrulanmalıdır.
Yaygın olarak kullanılan STP protokolünün önemli modifikasyonları arasında, enfekte ve iltihaplı karaciğer, dalak ve Peyer yamalarında özellikle güçlü olan yeşil-sarı otofloresan girişimini azaltmak için fotoçoğaltıcı 211'in önüne 510/20 nm'lik dar bir bant geçiren filtre yerleştirilmesi yer alır. Bu tür organların beyne kıyasla (STP'nin diğer uygulamalarına hakim olan) güçlü otofloresan ve artan ışık saçılımı da düzensiz aydınlatma için daha etkili bir düzeltme ihtiyacı yaratır. Başka bir değişiklik olarak, bu protokol bu amaç için CIDRE yaklaşımı22'yi (Şekil 3) ve bakterilerin yapay zeka tabanlı segmentasyonunu kullanır. Son olarak, doku ön işlemesi, doku otofloresansını azaltan ve böylece nispeten zayıf floresan11 ile küçük patojen hücrelerinin saptanmasını kolaylaştıran -20 ° C'de kriyoprotektan içinde bir inkübasyon aşaması dahil edilerek değiştirildi.
Hiçbir patojen sinyali tespit edilemezse veya segmentasyon yetersiz hassasiyet (çok fazla patojen hücresi kaçırılır) veya yetersiz hassasiyet (çok fazla arka plan partikülü patojen hücresi olarak segmentlere ayrılır) verirse sorun giderme gerekli olabilir. Arka plan dokusu otofloresansı tespit edilebiliyorsa ancak çok az patojen sinyali varsa, patojenler yetersiz miktarda floresan proteini içerebilir. Bu, aynı enfekte dokudan alınan doku kesitlerinin konfokal mikroskobu veya doku homojenatlarının akış sitometrisi kullanılarak test edilebilir19,28. Altta yatan nedenler yetersiz ifade seviyeleri veya ifade kasetinin kararsızlığı olabilir. Azaltma stratejileri, ekspresyonu yönlendirmek için alternatif promotörleri, patojen türleri için floresan proteini kodlayan genlerin kodon adaptasyonunu, daha yüksek kopya sayısına sahip epizomal yapıların kullanılmasını veya kromozomal entegrasyon veya dengeli-ölümcül tamamlama ile ekspresyon kasetlerinin stabilizasyonunu içerebilir29. Floresan protein seçimi de önemlidir, ancak GFP.mut2, mWasabi, YPet ve TIMERbac ile tespit mümkündür. Segmentasyon yanlışsa, bunun nedeni yukarıda açıklandığı gibi ele alınabilecek çok zayıf patojen floresansı veya çok yüksek doku otofloresan arka planı olabilir. Agaroz bloğuna ve tomografiye gömülmeden hemen önce geniş kapsamlı yıkama solüsyonu perfüzyonu veya depolama tamponunda uzun süreli inkübasyon bu sorunları çözebilir. Son olarak, hassas sınıflandırma için sinir ağının yeterli eğitimi gereklidir, ancak aşırı eğitim, yeni örnekler için performansı bozan aşırı öğrenmeye yol açabilir.
Şu anda, başka hiçbir yöntem, tek tek bakterileri tespit etmek için tüm organları 3D olarak yeterli uzamsal çözünürlükte görüntüleyemez. Doku temizleme ve ışık tabakası mikroskobundaki gelecekteki gelişmeler benzer bir çözünürlük elde edebilir. Bu, daha yüksek hızda ve daha fazla floresan kanalıyla görüntülemeyi mümkün kılabilir.
STP'nin önemli bir sınırlaması, ~ 0.5 μm'lik düzlem içi piksel çözünürlüğü ve 5 ila 10 μm'lik dikey çözünürlüktür, bu da örneğin yoğun bir şekilde paketlenmiş bir mikrokoloni içinde yakın yerleşimli bakterileri çözmek için yetersizdir. Bununla birlikte, seçilen doku parçalarının sekonder yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskobu için tomografi sonrası doku kesitleri almak mümkündür. STP'nin bir başka sınırlaması, aynı anda görüntülenebilen florofor sayısını kısıtlayan yalnızca üç floresan kanalının bulunmasıdır. Yine alınan doku kesitlerinin çoğullama yöntemleri ile sekonder analizi, seçilen doku parçaları için çok daha fazla markörün yerini ve yoğunluğunu ortaya koyabilmektedir. Bu bilgi, STP ile belirlendiği gibi çevredeki dokunun genel 3D yapısına entegre edilebilir.
Sonuç olarak, bu protokol konak-patojen etkileşimlerinin lokal ve tüm organ düzeyinde ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar. Protokol, diğer patojenlere (floresan suşlar olarak elde edilebilmeleri şartıyla), diğer organlara ve farklı konakçı türlere kolayca uyarlanabilir olmalıdır.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı 310030_156818, 310030_182315 ve NCCR_ 180541 AntiResist (DB'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
- Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
- Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M.
- Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
- Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
- Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
- Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
- Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
- Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
- Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
- Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
- Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
- Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
- Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
- Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).
