Summary
הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי תאי כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות למטרות חלבון.
Abstract
חלבונים הם בסיסיים לפיזיולוגיה האנושית, כאשר המטרות שלהם הן קריטיות במחקר ופיתוח תרופות. זיהוי ותיקוף של מטרות חלבון חיוניות הפכו לחלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות. עגינה מולקולרית היא כלי חישובי הנמצא בשימוש נרחב כדי לחקור קשירת ליגנד חלבון, במיוחד בהקשר של אינטראקציות מטרה בין תרופות וחלבונים. לצורך אימות ניסיוני של הקשירה וכדי לגשת ישירות לקשירת התרופה ומטרתה, נעשה שימוש בשיטת בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA). מחקר זה נועד לשלב עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לחזות ולאמת אינטראקציות בין תרופות ומטרות חלבון חיוניות. באופן ספציפי, חזינו את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1, כמו גם את מצב הקישור שלו באמצעות ניתוח עגינה מולקולרית, ולאחר מכן אימות של האינטראקציה באמצעות בדיקת CETSA. התוצאות שלנו הראו כי קסנטטין יכול ליצור קשרי מימן עם שאריות חומצות אמינו ספציפיות של חלבון Keap1 ולהפחית את היציבות התרמית של חלבון Keap1, מה שמצביע על כך שקסנטטין יכול לקיים אינטראקציה ישירה עם חלבון Keap1.
Introduction
חלבונים הם מקרומולקולות חשובות ביותר באורגניזמים חיים ויש להם מגוון רחב של פונקציות ייחודיות בתוך התאים, כגון הרכב הממברנה, היווצרות שלד ציטו-שלד, פעילות אנזימים, תחבורה, איתות תאי, ומעורבות במנגנונים תוך-תאיים וחוץ-תאיים 1,2,3. חלבונים מבטאים את תפקידיהם הביולוגיים בעיקר באמצעות אינטראקציות ספציפיות עם מגוון מולקולות, כולל חלבונים אחרים, חומצות גרעין, ליגנדות של מולקולות קטנות ויוני מתכת 1,4. ליגנדות הן תרכובות מולקולריות קטנות שנקשרות באופן ספציפי לחלבונים באורגניזם. האינטראקציה בין חלבונים לליגנדות מתרחשת באתרים ספציפיים על החלבון, הנקראים אתרי הקשירה, הידועים גם בשם כיסי הקישור5. במחקר כימיה תרופתית, ההתמקדות היא בזיהוי חלבוני מפתח הקשורים בבירור למחלות, המשמשים מטרות לתרופות6. לכן, הבנה מעמיקה של אתרי הקישור בין חלבונים לליגנדות היא בעלת חשיבות עליונה בקידום גילוי, תכנון ומחקר של תרופות 7,8.
עגינה מולקולרית היא כלי חישובי נפוץ לחקר קשירת ליגנד חלבון, המשתמש במבנים תלת-ממדיים של חלבונים וליגנדים כדי לחקור את מצבי הקישור והזיקות העיקריים שלהם בעת יצירת קומפלקסים יציבים 9,10,11. היישום של טכנולוגיית עגינה מולקולרית מקורו בשנות השבעים. בהתבסס על עקרון זיווג המנעול והמפתח ותוך שימוש באלגוריתמים של תוכנות עגינה מולקולריות, ניתן לקבוע את האינטראקציה בין תרכובות ומטרות מולקולריות על ידי ניתוח תוצאות העגינה. גישה זו מאפשרת חיזוי של אתרי קישור פעילים הן עבור התרכובת והן עבור מולקולת המטרה. כתוצאה מכך, הוא מאפשר זיהוי של קונפורמציית קישור אופטימלית (הנקראת כאן מודל הקשירה) עבור אינטראקציות ליגנד-קולטן, שהיא חיונית להבנת המכניקה של התקשרויות מולקולריות אלה 12,13,14,15. בעוד עגינה מולקולרית מספקת תחזיות מבוססות מחשב יקרות ערך של אינטראקציות ליגנד-קולטן, חשוב לציין כי מדובר בממצאים ראשוניים. כתוצאה מכך, אימות ניסיוני נוסף חיוני כדי לאשר אינטראקציות אלה.
בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA), שהוצעה לראשונה על ידי צוות המחקר של פאר נורדלונד בשנת 2013, משמשת כשיטה לאימות אינטראקציות חלבון מטרה לתרופה. טכניקה זו בודקת באופן ספציפי את היציבות התרמית של חלבוני מטרה המושרים על ידי קשירת תרופות, ומספקת גישה מעשית לאישור אינטראקציות מולקולריות 16,17,18. גישה זו מבוססת על העיקרון הבסיסי שקשירת ליגנדים יוצרת שינוי תרמי בתוך חלבוני המטרה וישימה למגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל ליזטים של תאים, תאים חיים שלמים ורקמות19,20. CETSA תומך במעורבות מטרה ישירה של מולקולות קטנות בתאים שלמים על ידי גילוי ייצוב תרמודינמי של חלבונים עקב קשירת ליגנד וקישור התגובה הפנוטיפית שנצפתה לתרכובת המטרה21,22. בין המתודולוגיות השונות הנגזרות מ- CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) נחשבת לגישה קלאסית. לאחר הכנת הדגימה בשיטת CETSA, נעשה שימוש בניתוח כתמים מערביים כדי לזהות שינויים ביציבות התרמית של חלבון המטרה. זה מאפשר קביעה מדויקת של אינטראקציות תרופה-חלבון בתוך מערכות תאיות17,23.
Xanthatin הוא תרכובת ביו-אקטיבית מבודדת מן הצמח Xanthium L. עם תכונות כגון אנטי דלקתיות, אשר שימש ברפואה הסינית המסורתית לטיפול במחלות כמו סינוסיטיס האף ודלקת פרקים24,25. חלבון 1 הקשור ל-ECH דמוי קלך (Keap1) הוא מרכיב של קומפלקס חלבונים רב-יחידות מבוסס Cullin-RING E3 Ubiquitin ligase Multi-subunit ומווסת חשוב של הומאוסטזיס חיזור תוך-תאי, המשפיע על עוצמת ומשך התגובה הדלקתית על ידי ויסות מצב חמצון-חיזור תוך-תאי26. במחקר זה השתמשנו לראשונה בעגינה מולקולרית כדי לחקור את האינטראקציה בין קסנטטין (מולקולה קטנה) וחלבון Keap1, במטרה לחזות את מצב הקישור שלהם. לאחר מכן, השתמשנו בשיטת CETSA כדי לאמת אינטראקציה זו על ידי הערכת ההשפעה של קסנטטין על היציבות התרמית של חלבון Keap1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הורדת המבנים של קסנטטין ו-Keap1
- פתח את מסד הנתונים PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), הזן xanthatin (מולקולה קטנה), ולאחר מכן לחץ על חיפוש ולחץ על התוצאה הראשונה. לחץ על הורד ולחץ להציל תחת מבנה דו-ממדי כדי לשמור את המתחם בפורמט .sdf.
- הורד את המבנה הגבישי של החלבון.
- פתח את מסד הנתונים UniProt (https://www.uniprot.org/), הזן Keap1 ולחץ על חיפוש. לחץ על Human תחת אורגניזמים פופולריים בעמודה הימנית ולאחר מכן לחץ על הערך הראשון בשם Q14145 בעמודה הימנית.
- לחץ על מבנה תחת הפונקציה בעמודה השמאלית, מצא את המבנה עם מזהה PDB: 2FLU, ולחץ על RCSB-PDB. לחץ על הורד קבצים ובחר פורמט PDB כדי להוריד את המבנה הגבישי של חלבון Keap1.
2. עגינה מולקולרית
- צור תיקייה חדשה בשם עגינה מולקולרית בשולחן העבודה ושמור את מבני הקסנטטין (מולקולה קטנה) ו- Keap1 (חלבון) שהורדו בתיקיה זו.
הערה: שם התיקיה והנתיב חייבים להיות באנגלית. - פתח את תוכנת Maestro, לחץ על קובץ, בחר שנה ספריית עבודה, לחץ על שולחן עבודה, לחץ פעמיים כדי לבחור את תיקיית העגינה המולקולרית החדשה שנוצרה ולחץ על בחר אפשרויות.
- עיבוד מולקולות קטנות
- לחץ על אפשרויות קובץ וייבוא מבנים, לחץ על שולחן עבודה, לחץ פעמיים על תיקיית עגינה מולקולרית, לחץ על קובץ מבנה קסנטטין ולאחר מכן לחץ על פתח כדי לייבא קובץ מולקולות קטנות.
- לחץ על משימות בפינה השמאלית העליונה של התוכנה ובחר באפשרות LigPrep . להשתמש במבנים מסביבת העבודה; שאר הפרמטרים הם פרמטרי ברירת המחדל ולחץ על הפעל כדי לבצע עיבוד מולקולות קטנות.
- עיבוד מבנה חלבון
- לחץ על האפשרויות File ו- Import Structures , לחץ על Desktop ולחץ פעמיים על התיקיה Molecular Docking . לחץ על הקובץ Keap1 Protein Structure ולאחר מכן לחץ על פתח כדי לייבא את קובץ מבנה החלבון.
- לחץ על משימות בפינה השמאלית העליונה של התוכנה ובחר באפשרות אשף הכנת החלבונים . סמן את התיבה לפני מחיקת מים מעבר ל- 5 Å מקבוצות Het והזן pH של 7.4+/-0.0. לחץ על Preprocess, לחץ על Refine, ולאחר מכן לחץ על Optimize > Remove Waters > Minimize.
- לחץ על המשימה הבאה לאחר השלמת המשימה הקודמת. לחץ על Tasks ובחר באפשרות Sitemap , השתמש בהגדרות ברירת המחדל לכל הפרמטרים ולחץ על Run.
- לחץ על אפשרויות File ו- Import Structures , לחץ על Desktop, לחץ פעמיים על תיקיית העגינה המולקולרית ופתח את התיקיה בשם sitemap_1. לחץ על הקובץ הראשון בשם Sitemap_1_out.maegz ולאחר מכן לחץ על פתח.
- לחץ פעמיים על הנקודה כדי לבחור sitemap_1_protein בסביבת העבודה ולאחר מכן לחץ על Sitemap_1_site_1 כדי לבחור אותה . לחץ על משימות ובחר באפשרות יצירת רשת קולטן .
הערה: אתרי החלבונים שנחזו על ידי מפת האתר מדורגים על פי הניקוד, כאשר האתר עם הניקוד הגבוה ביותר מלכתחילה. - בחר באפשרות Enter תחת receptor, כאשר שאר הפרמטרים ללא שינוי. לחץ על הכדור הלבן הקטן במבנה החלבונים כדי ליצור תיבת עגינה בגודל ברירת המחדל ושנה את שם העבודה ל- glide-grid_2FLU. לחץ על הפעל.
- עגינה מולקולרית
- לחץ על משימות ובחר באפשרות עגינה ליגנד . בחר את Receptor Grid As מהקובץ ולחץ על Browse. לחץ על שולחן עבודה, לחץ פעמיים על תיקיית עגינה מולקולרית, לחץ פעמיים על קובץ grid_2FLU גלישה, לחץ על קובץ Glide-grid_2FLU.zip ולאחר מכן לחץ על פתח.
- לחץ על השתמש בליגנדות מקבצים > עיין בשולחן העבודה >. לחץ פעמיים על תיקיית העגינה המולקולרית, לחץ פעמיים על קובץ ligprep_1, לחץ על קובץ Ligprep_1-out.maegz ולאחר מכן לחץ על פתח.
- לחץ על הגדרות ובחר באפשרות דיוק כ- XP (דיוק נוסף), שנה את שם המשימה ל- glide-dock_XP_2FLU ולחץ על הפעל.
- הצגת תוצאות עגינה
- לחץ על האפשרויות File ו- Import Structures , לחץ על Desktop ולחץ פעמיים על התיקיה Molecular Docking . לחץ פעמיים על הקובץ glide-dock_XP_2FLU , לחץ על הקובץ glide-dock_XP_1_pv.maegz ולאחר מכן לחץ על פתח.
- לחץ פעמיים על הנקודה כדי לבחור ליגנד בסביבת העבודה ולאחר מכן לחץ כדי לבחור sitemap_1_protein. לחץ על טבלה, החלק לקצה השמאלי והצג את התוצאה תחת ניקוד עגינה.
- ויזואליזציה של תוצאות דו-ממדיות
- לחץ פעמיים על הנקודה כדי לבחור ליגנד בסביבת העבודה, ולאחר מכן לחץ כדי לבחור גם sitemap_1_protein. לחץ על אינטראקציית ליגנד > תצוגה וסמן את התיבה מקרא LID .
- לחץ על קובץ, בחר שמור צילום מסך, הזן 6000 ברוחב, בטל את סימון התיבה עבור רקע שקוף ולחץ על אישור. לחץ על שולחן העבודה, שם הקובץ כמו 2D-xanthatin-2FLU, ולשמור את התמונה.
- הדמיה של תוצאות תלת מימד
- לחץ פעמיים על הנקודה כדי לבחור ליגנד בסביבת העבודה, ולאחר מכן לחץ כדי לבחור גם sitemap_1_protein.
- לחץ על L בבחירה מהירה כדי לבחור מולקולות קטנות ולאחר מכן לחץ על סגנון. לחץ על השורה השנייה בסגנון כדי לשנות את גודל הקשר של המולקולה הקטנה ולחץ על אטומי הצבע כדי לשנות את צבע המולקולה הקטנה.
- בחר את המולקולה הקטנה באיור, לחץ על לחצן העכבר הימני, בחר הרחב בחירה ובחר 4 Å. לחץ על החל תוויות בסגנון כדי להציג את התוויות.
- לחץ על השורה השנייה בסגנון כדי לשנות את גודל קשרי חומצות האמינו ולחץ על אטומי הצבע כדי לשנות את צבע חומצות האמינו.
- לחץ על Next > Invert, החזק את מקש הבקרה ולחץ על מיקום העין הראשונה תחת סגנון כדי להציג רק את חומצות האמינו עם התוויות.
- לחץ על סגנון > סרטים כדי להציג את החלבון כסגנון רצועת כלים ולחץ על ערוך רצועת כלים תחת סרטים כדי לשנות את צבע רצועת הכלים.
- לחץ על Interactions Toggle בפינה השמאלית התחתונה של המסך, לחץ על לחצן העכבר הימני ובטל את הסימון של אנשי קשר/עימותים.
- חפש מדידה במשימות, בחר מרחק, ולחץ על שני האטומים המחוברים על ידי הקו המקווקו הצהוב (קשר מימן) במסך כדי למדוד אורכי קשרי מימן.
- לחצו לחיצה ממושכת על גלגל העכבר כדי לסובב את החלבון, התאימו את החלבון למרכז המסך וודאו שכל תווית של חומצות אמינו גלויה.
- לחץ על סביבת עבודה > שמור תמונה בשם ולחץ על שולחן העבודה. שמור את התמונה כ- 600dpi כברירת מחדל, תן לקובץ את השם 3D-xanthatin-2FLU, בחר סוג קובץ כתבנית tiff ושמור את התמונה.
3. תרבית תאים והכנת דגימת CETSA
- תרבית תאים
- הוסף 5 x 106 תאים RAW264.7 / מ"ל לצלחת תרבית של 100 מ"מ ודגור עם 6 מ"ל של מדיום DMEM עם 10% FBS ו 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2. הכינו שלוש מנות ובצעו את הניסוי כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%.
- הכנת מדגם CETSA
- שאפו את המדיום הישן, הוסיפו 2 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS) שחומם לטמפרטורת החדר לכל מנה, ושטפו פי 2.
- הוסיפו 2 מ"ל PBS לכל צלחת תאים, ערבבו את התאים ואספו תאים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 377 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש להשליך את תאי הסופרנאטנט ולהשהות מחדש עם 2 מ"ל PBS המכילים 1% תערובות מעכבי פרוטאז רחבי-ספקטרום. מחלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגות בודדות עם 1 מ"ל של תרחיף תאים בכל אחד.
- יש להקפיא צינורות מיקרוצנטריפוגות בחנקן נוזלי עד למוצק לבן, ואז להפשיר מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולחזור על הפעולה 3x. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות.
- קח שני צינורות מיקרוצנטריפוגה, אחד עם 100 מיקרומטר xanthatin ואחד עם נפח שווה של DMSO, ולהוסיף 450 μL של supernatant צנטריפוגה לכל צינור, לדגור ב 37 ° C במשך 30 דקות.
- הוסף את הסופרנאטנט משני צינורות המיקרוצנטריפוגות ל-14 צינורות PCR בנפח של 60 מיקרוליטר/צינור, ושפופרות חום בו זמנית בטמפרטורות משתנות (45°C, 48°C, 51°C, 54°C, 57°C, 60°C ו-63°C) למשך 3 דקות, עם שני צינורות PCR בכל טמפרטורה, עבור קבוצות DMSO ו-xanthatin, בהתאמה.
- עבור הקבוצה הלא מחוממת, קח supernatant מכל אחד משני צינורות microcentrifuge ולהוסיף 14 צינורות PCR, 7 עבור קבוצת DMSO ו 7 עבור קבוצת xanthatin, בנפח של 60 μL כל אחד. אין לחמם את הדגימות כאן.
- מצננים את הצינורות בטמפרטורת החדר עבור הקבוצה המחוממת. צנטריפוגה את כל הצינורות (מחוממים ולא מחוממים) ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולקחת 48 μL של supernatant מכל צינור לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. יש להוסיף 12 μL של חיץ העמסת חלבון SDS-PAGE לכל צינור, מערבולת כדי לערבב היטב, ולחמם באמבט מים ב 100 ° C במשך 5 דקות.
הערה: דגימות CETSA מוכנות חייבות להיות מאוחסנות בטמפרטורה של -80°C ולהיבדק על ידי Western Blot תוך שבוע.
4. כתם מערבי
- הכנת ג'ל SDS-PAGE
- יש לשטוף צלחת זכוכית אחת ארוכה ואחת קצרה במים טהורים במיוחד. הניחו את הצלחות בחריץ ההידוק ולאחר מכן על לוח שקוף. הוסיפו מים טהורים במיוחד ובדקו נזילות למשך 10 דקות.
- מוסיפים 8 מ"ל של תמיסת ג'ל תחתונה ו-8 מ"ל של חיץ ג'ל תחתון לתוך בקבוק חרוטי ומערבבים על ידי ניעור עדין. מוסיפים 160 μL של מקדם קרישה לתמיסת הג'ל ומערבבים היטב.
הערה: נפח שכבת הדבק התחתונה לא יעלה על הקו הירוק בחריץ ההידוק. - מסננים את המים האולטרה-טהורים מהצלחות ומייבשים אותם בנייר פילטר. מוסיפים את תמיסת הג'ל התחתון המוכנה. מוסיפים 2 מ"ל אלכוהול איזופרופיל וממתינים 20 דקות להתמצקות.
- קח 2 מ"ל של תמיסת ג'ל עליונה ו 2 מ"ל של חיץ ג'ל עליון לתוך בקבוק חרוטי וערבב על ידי ניעור עדין של הצלוחית.
- מוציאים את האיזופרופיל אלכוהול משכבת הג'ל ומכתימים את עודפי האיזופרופיל אלכוהול בנייר פילטר.
- מוסיפים 40 μL של מקדם קרישה לתמיסת הג'ל העליונה המעורבת, מערבבים היטב, ואז מוסיפים בין לוחות הזכוכית הארוכים והקצרים ומכניסים מסרק 1.5 מ"מ 15 חורים, ממתינים 20 דקות.
הערה: יש להכניס את המסרק בניצב לשכבה העליונה, ללא בועות אוויר בין המסרק לתמיסה.
- אלקטרופורזה
- הוסיפו ליטר אחד של מים טהורים במיוחד לכוסית, הוסיפו שקית של אבקת חיץ ריצה SDS-PAGE, ערבבו היטב עם מוט זכוכית והוסיפו את הג'ל המוכן ליחידת האלקטרופורזה. מניחים את היחידה בקופסה ושולפים את המסרק.
- סמן הפשרה ודגימות CETSA בטמפרטורת החדר, מערבולות ומסתובבות. הוסף 2.5 μL סמן לבאר הראשונה ו- 20 μL של דגימות CETSA לכל אחת מהבארות הנותרות בהתאם לרצף שנקבע מראש.
הערה: דגימות CETSA נוספו ברצף בהתאם לטיפול בטמפרטורה המתואר בשלב 3.2.6 מ- 45 ° C עד 63 ° C; קבוצת DMSO נוספה ראשונה, ואז קבוצת הקסנטטין (איור 1). - הוסף את תמיסת האלקטרופורזה הנותרת ליחידת האלקטרופורזה, סגור את המכסה והכנס את האלקטרודה, קוטב חיובי לקוטב חיובי, קוטב שלילי לקוטב שלילי.
- הפעל את מתג ההפעלה וכוונן את מתג המתח ל- 80 V כדי להפעיל אלקטרופורזה.
- העברה לממברנה
- מוסיפים 850 מ"ל מים טהורים במיוחד, 100 מ"ל אתנול נטול מים ו-50 מ"ל של חיץ העברה מהירה לכוס ומערבבים היטב. הכינו לוח קצף, סכיני פלסטיק, פינצטה, מגשים והתקני העברת ממברנה.
- חותכים את קרום PVDF בהתאם לגודל הג'ל, מסמנים אותו ומשרים אותו במתנול למשך 30 שניות כדי להפעיל אותו.
- יוצקים את תמיסת ההעברה למגש, מניחים ופותחים את מהדקי ההעברה, ומניחים משטח ספוג ושלוש שכבות של נייר סינון העברה.
- עצור אלקטרופורזה ולאחר מכן פתח את המכסה של תיבת האלקטרופורזה. קח את מכשיר האלקטרופורזה, שפך את תמיסת האלקטרופורזה והסר את הצלחת. הניחו את הצלחת על לוח הקצף, חטטו אותה בעדינות עם סכין פלסטיק וחתכו את הג'ל כדי לדמיין בבירור את סמן החלבון ואת חלבוני המטרה.
- החזיקו צד אחד של הטוש בפינצטה, שטפו אותו במגש המכיל את התמיסה הטרנסממברנלית והניחו אותו שטוח על נייר פילטר. טבלו את קרום PVDF הפעיל בתמיסת ההעברה, החזיקו את הצד המסומן בפינצטה וכסו את הג'ל עם הפנים כלפי מטה.
הערה: הצד המסומן בקרום PVDF הוא הצד הקדמי ושימו לב לכך שלא נוצרות בועות במהלך תהליך המיקום. - הניחו שתי שכבות של נייר מסנן העברה ושכבה אחת של משטח ספוג על קרום PVDF, כסו ומהדקים את אטבי ההעברה והכניסו אותם למיכל ההעברה.
הערה: צבע שחור של תפס העברה לצבע שחור של חריץ העברה. - הוסף את הפתרון transmembrane הנותרת לקלטת transmembrane, לכסות עם המכסה, חיובי לחיובי, שלילי לשלילי.
- התאם את הזרם ל- 400 mA, זמן ל- 30 דקות ולאחר מכן הקש Run כדי להתחיל להעביר את הממברנה בטמפרטורת החדר.
- חסימת
- הוסף 2 ליטר מים טהורים במיוחד לבקבוקון זכוכית, הוסף שקית אבקת TBS ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של טווין להכנת תמיסת TBST. שקלו את אבקת ה-BSA להכנת תמיסת 5% BSA עם TBST והוסיפו 6 מ"ל של תמיסת BSA לקופסת הדגירה.
- עצור את העברת הממברנה ולאחר מכן פתח את תפס ההעברה. הדקו את צד הסמן של קרום PVDF והניחו אותו בקופסת הדגירה. מניחים את קופסת הדגירה על שייקר וחוסמים למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
- דגירה של נוגדן ראשוני
- הכינו את הנוגדן הראשוני (ראו טבלת חומרים לפרטים) עם תמיסת 5% BSA בקנ"מ 1:1000, מחזרו את תמיסת ה-BSA בקופסת האינקובטור והוסיפו 6 מ"ל נוגדן ראשוני לקופסת הדגירה. מניחים את קופסת הדגירה בקופסת קצף עם שקיות קרח ושומרים אותה על שייקר למשך הלילה.
- דגירה של נוגדן משני
- אספו את הנוגדן הראשוני בקופסת הדגירה למחרת, ואז הוסיפו 6 מ"ל של תמיסת TBST והניחו אותו על שייקר לשטיפה למשך 5 דקות.
- יוצקים את פתרון TBST שטוף ולהוסיף טרי לכביסה; חזור על הפעולה 5x והכן את הנוגדן המשני עם תמיסת BSA 5% בשעה 1:5000.
- יוצקים את תמיסת TBST ומוסיפים 6 מ"ל של נוגדנים משניים לקופסת הדגירה. מניחים את קופסת הדגירה על שייקר ודגרים במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
- אספו את הנוגדן המשני (ראו טבלת חומרים לפרטים), ואז הוסיפו 6 מ"ל של תמיסת TBST והניחו אותו על שייקר לכביסה למשך 5 דקות. יוצקים את פתרון TBST שטוף ולהוסיף טרי לכביסה; חזור על הפעולה 5x.
- חשיפת הרצועות
- שמור על תמיסת TBST בסוף הכביסה האחרונה. קחו כמויות שוות של ריאגנטים כימילומינסנטיים A ו-B, נערו וערבבו היטב. הגן על התמיסה מפני אור.
- פתחו את מערכת הדמיית הג'ל, לחצו על דגימות, בדקו כיול, המתינו להשלמת הכיול, ואז לחצו על מרקר, בדקו כיול.
- הרימו את צד הטוש של הרצועה עם פינצטה ושקעו לחלוטין בתמיסת מגיב כימילומינסנטית. הדקו צד אחד של הסמן כדי למקם את הרצועה עם הפנים כלפי מטה במכונת הצילום, סגרו את מכסה מכונת הצילום, לחצו על 'חשיפה' וכוונו את זמן החשיפה לשנייה אחת.
הערה: על היזם לכסות לחלוטין את הרצועה, והפיתוח צריך להיות בסביבה חשוכה. - לחץ על שמור, תן שם לתמונה ושמור אותה כקובץ .tif. לנתח את הצפיפות האופטית של הכתם המערבי. הערכים האפורים של כל טמפרטורה בקבוצת DMSO הושוו לערכים האפורים של 45 ° C, והערכים האפורים של כל טמפרטורה בקבוצת הקסנטטין הושוו לערכים האפורים של קסנטטין ב- 45 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח עגינה מולקולרית ניבא את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1. איור 2 מדגים היווצרות קשרי מימן בין שאריות קסנטטין וחומצות אמינו Gly-367 ו-Val-606 של חלבון Keap1, עם אורך קשר מימן של 2.17 Å עבור Gly-367 ו-2.13 Å עבור Val-606. בנוסף, ציון העגינה המחושב של -5.69 קק"ל/מול מסמל זיקה טובה בין קסנטטין לחלבון Keap1.
שיטת CETSA הראתה כי קשירת קסנטטין שינתה את היציבות התרמית של חלבון Keap1, ואישרה את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap121. איור 3 מצביע על כך שקסנטטין משנה באופן מדהים את היציבות התרמית של חלבון Keap1 בטווח הטמפרטורות של 48°C עד 57°C, בהשוואה לקבוצת DMSO. כדי להבטיח העמסת דגימות שווה, ראשית, צפיפות החיסון התאית שבה ביצענו את הניסויים הייתה עקבית; שנית, דגימות התאים מקבוצת DMSO ומקבוצת הקסנטטין עורבבו היטב בצלחות תרבית התאים ולאחר מכן חולקו באופן שווה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה, שהבטיחו את הכמות העקבית של דגימות התא, ונפח הסופרנאטנט שנוסף לכל צינור PCR היה 60 μL, ולבסוף, הנפח של כל דגימה שהועלתה בכתם המערבי היה 20 μL, מה שהבטיח העמסה שווה לדגימות מחוממות. פירוק חלבונים בדגימות מסביבות 51 מעלות צלזיוס נובע בעיקר משינויים במבנה החלבון ותגובות כימיות מואצות הנגרמות על ידי טמפרטורות גבוהות. התוצאות לעיל מראות כי קסנטטין יכול להיקשר ישירות לחלבון Keap1.
איור 1: סדר ההעמסה של כתם מערבי. הטמפרטורה לפי הסדר משמאל לימין הייתה 45 °C (75 °F), 48 °C (75 °F), 51 °C (75 °F), 54 °C (57 °F), 60 °C (60 °F) ו- 63 °C (63 °F). הנתיב הראשון נוסף עם טוש; שני נתיבים שימשו לכל טמפרטורה; הנתיב הראשון היה קבוצת DMSO, והנתיב השני היה קבוצת קסנטטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1 (PDB: 2FLU). (A) הייצוג הדו-ממדי של קשירת קסנטטין ל-Keap1. (B) הדמיה תלת-ממדית של קסנטטין וחלבון Keap1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעת קסנטטין על היציבות התרמית של חלבון Keap1. (A) ההשפעות של קסנטטין על היציבות התרמית של Keap1 זוהו על ידי CETSA. (B) הצפיפויות האופטיות של Keap1 נורמלו לאלה שהתקבלו ב-45°C. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA חד-כיוונית). n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי מטרות המחלה וגילוי ופיתוח תרופות קשורים קשר הדוק27. על ידי מיקוד מדויק במטרות ספציפיות, ניתן לפתח תרופות מועמדות לטיפול יעיל יותר במחלות מסוימות תוך מזעור תופעות הלוואי הקשורות לתרופות28,29. המטרות הנפוצות ביותר הן מטרות חלבון30. עם זאת, זיהוי מטרות חלבון מיוחדות מציב אתגר עצום בשל המגוון הרחב של חלבונים בתוך תאים30,31. במאמר זה אימצנו גישה המשלבת עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לזהות ולאמת מטרות חלבוניות. התוצאות חשפו אינטראקציה ישירה בין קסנטטין לחלבון Keap1. שילוב של טכנולוגיית מחשב וניסויים ביולוגיים יכול לשמש גם בחקירה של תרופות אחרות ומטרות חלבון כדי לוודא את נוכחותה של אינטראקציה ישירה בין התרופה לבין המטרה. גישה זו, המשלבת חיזוי עם אימות, מפחיתה ביעילות הן את צריכת הזמן והן את העלויות הכלכליות. יתר על כן, המכשירים והחומרים הניסיוניים קלים להשגה, ותהליך התפעול אינו מסובך. לבסוף, דגימות CETSA קלות להכנה ולבדיקה בשיטת הכתם המערבי, המבטיחה את יכולת השחזור של הדגימות.
מניסיוננו, ישנם מספר היבטים קריטיים הדורשים תשומת לב מיוחדת במהלך הליכי ניסוי. ראשית, חיוני לבחור את המבנה הגבישי של החלבון שנפתר על ידי ניתוח קרני רנטגן בעת בחירת מבנה החלבון לפני עגינה מולקולרית. שנית, צפיפות התאים וזמן הקפאה/הפשרה הם גורמים מכריעים בניסויי CETSA. תאים בשלב הגידול הלוגריתמי צריכים להיבחר לניסויי CETSA מכיוון שמצב הצמיחה שלהם יציב ויש לו השפעה מינימלית על תוצאות הניסוי. במהלך הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של תאים, התזמון צריך להיות מבוקר היטב עם חנקן נוזלי המשמש להקפאה עד להיווצרות מוצק לבן, ולאחר מכן הפשרה מיידית בטמפרטורת החדר לפני מחזורי ההקפאה הבאים. לבסוף, יש להשלים את ניסויי הכתם המערבי מיד לאחר הכנת דגימות CETSA כדי למנוע פירוק חלבונים.
עגינה מולקולרית ו- CETSA הן טכניקות מבוססות היטב הממלאות תפקיד מכריע בתחום פיתוח התרופות. עגינה מולקולרית מסייעת בחיזוי אינטראקציות ברמה מולקולרית בין תרכובות לבין מטרותיהן, ומציעה תובנות חשובות לגבי מצבי קישור פוטנציאליים10,11. CETSA, לעומת זאת, מתמקד בהערכת ההשפעה של תרופות על יציבות תרמית של חלבונים ומשמש כלי לאימות אינטראקציות בין תרופותלחלבונים 17. בעוד CETSA היא שיטה פשוטה יחסית לאימות, היא גם דרך תפוקה נמוכה על ידי שימוש בכתם מערבי לחקר שינוי תרמי של קומפלקס חלבון תרופה, וזה לא צריך להיות הטכניקה היחידה להסתמך על. בנוסף, השלבים של CETSA הם מסובכים, וכל שגיאות צעד במהלך המבצע יכול להיות בעל השפעה רבה על התוצאות. יתר על כן, שיטת CETSA אינה יכולה לקבוע את אתר הקישור הספציפי ואת אופן הקישור של התרכובת ליעד החלבוני ואינה יכולה לציין אם הקישור הוא קוולנטי או לא קוולנטי 17,18,23. מעבר לבדיקת שינוי תרמי, סוגים אחרים של בדיקות אנרגטיות, כגון משקעים חלבוניים תלויי pH (pHDPP), יכולים לשמש גם לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון32. יתר על כן, פרופיל פרוטאום תרמי הוא שיטה מבוססת אנרגיה לחשיפת אינטראקציות ליגנד-חלבון, המאפשרת ניתוח בקנה מידה גדול בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-תרופה על ידי שילוב פרוטאומיקה עם CETSA33.
בנוסף, תהודה פלסמונית פני שטח מקומית (LSPR) יכולה לספק ניתוח איכותי וכמותי נוסף34,35. הוא לא רק קובע את קיומן של אינטראקציות בין תרופה למטרה שלה, אלא גם מודד את פרמטרי הזיקה והפרמטרים הקינטיים של אינטראקציות בין-מולקולריות אלה, ומציע הבנה מקיפה יותר.
מעבר לבדיקת שינוי תרמי, משקעים חלבוניים תלויי pH (pHDPP) יכולים לשמש גם לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון32. עגינה מולקולרית היא שיטת סימולציה מבוססת פיזיקו-מכניקה לחיזוי אינטראקציות בין מולקולות קטנות לביומולקולות. שיטה זו שואפת להשיג קשירה על ידי אופטימיזציה של קונפורמציה וכיוון של מולקולות קטנות כדי לייצר את המשלימות הטובה ביותר בינן לבין ביומולקולות. חיזוי מטרה משתמש בטכניקות בינה מלאכותית כדי לחזות את אתרי הקישור בין מולקולות קטנות לביומולקולות. לשתי הגישות יש הבדלים מרכזיים ביישום השיטה ובדיוק החיזוי. יישום השיטה: עגינה מולקולרית משמשת בעיקר לתכנון ואופטימיזציה של תרופות, ומספקת בסיס תיאורטי לגילוי תרופות חדשות. חיזוי מטרות, בעזרת בינה מלאכותית מתקדמת יותר, מיושם לעתים קרובות יותר לסינון בתפוקה גבוהה ולגילוי מהיר של תרכובות עופרת כדי לשפר את יעילות גילוי התרופות. דיוק החיזוי: מכיוון שהעגינה המולקולרית מבוססת על סימולציות פיזיקליות, דיוק החיזוי שלה גבוה יותר, אך גם העלות החישובית גבוהה יחסית. בעוד לחיזוי מטרות יש עלות חישובית נמוכה יותר, דיוק החיזוי תלוי בשפע נתוני האימון ובבחירת המודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82004031) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022NSFSC1303). אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בכתם המערבי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A.
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
