प्रोटीन लक्ष्य भविष्यवाणी और छोटे अणु यौगिक का सत्यापन
Summary
यहाँ इस्तेमाल प्रयोग आणविक डॉकिंग की एक विधि से पता चलता है सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख के साथ संयुक्त भविष्यवाणी और छोटे अणुओं और प्रोटीन लक्ष्यों के बीच बातचीत मान्य करने के लिए.
Abstract
प्रोटीन मानव शरीर विज्ञान के लिए मौलिक हैं, उनके लक्ष्य अनुसंधान और दवा विकास में महत्वपूर्ण हैं। महत्वपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों की पहचान और सत्यापन दवा विकास का अभिन्न अंग बन गया है। आणविक डॉकिंग एक कम्प्यूटेशनल उपकरण है जिसका व्यापक रूप से प्रोटीन-लिगैंड बाइंडिंग की जांच के लिए उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से दवा और प्रोटीन लक्ष्य इंटरैक्शन के संदर्भ में। बाध्यकारी के प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए और दवा और उसके लक्ष्य के बंधन को सीधे एक्सेस करने के लिए, सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (सीईटीएसए) विधि का उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन का उद्देश्य दवाओं और महत्वपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के बीच बातचीत की भविष्यवाणी और मान्य करने के लिए सीईटीएसए के साथ आणविक डॉकिंग को एकीकृत करना है। विशेष रूप से, हमने xanthatin और Keap1 प्रोटीन के साथ-साथ आणविक डॉकिंग विश्लेषण के माध्यम से इसके बाध्यकारी मोड के बीच बातचीत की भविष्यवाणी की, इसके बाद CETSA परख का उपयोग करके बातचीत का सत्यापन किया। हमारे परिणामों से पता चला है कि xanthatin Keap1 प्रोटीन के विशिष्ट अमीनो एसिड अवशेषों के साथ हाइड्रोजन बांड स्थापित कर सकता है और Keap1 प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी को कम कर सकता है, यह दर्शाता है कि xanthatin सीधे Keap1 प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकता है।
Introduction
प्रोटीन जीवित जीवों में अत्यधिक महत्वपूर्ण macromolecules हैं और झिल्ली संरचना, cytoskeleton गठन, एंजाइम गतिविधि, परिवहन, सेल संकेतन, और दोनों intracellular औरबाह्य तंत्र 1,2,3 में भागीदारी के रूप में कोशिकाओं के भीतर अद्वितीय कार्यों की एक विविध रेंज के अधिकारी. प्रोटीन मुख्य रूप से अन्य प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, छोटे अणु ligands, और धातुआयनों 1,4 सहित अणुओं की एक किस्म के साथ विशिष्ट बातचीत के माध्यम से उनके जैविक कार्यों को प्रकट. लिगैंड छोटे आणविक यौगिक होते हैं जो विशेष रूप से एक जीव में प्रोटीन से बंधते हैं। प्रोटीन और लिगेंड के बीच बातचीत प्रोटीन पर विशिष्ट साइटों पर होती है, जिसे बाध्यकारी साइटें कहा जाता है, जिसे बाध्यकारी जेब5 के रूप में भी जाना जाता है। औषधीय रसायन विज्ञान अनुसंधान में, ध्यान उन प्रमुख प्रोटीनों की पहचान करने में निहित है जो स्पष्ट रूप से बीमारियों से जुड़े हैं, जो दवाओं के लिए लक्ष्य के रूप में कामकरते हैं। इसलिए, प्रोटीन और ligands के बीच बाध्यकारी साइटों की गहरी समझ प्राप्त करने दवा की खोज, डिजाइन, और 7,8 अनुसंधान को बढ़ावा देने में अत्यंत महत्वपूर्ण है.
आणविक डॉकिंग प्रोटीन-लिगैंड बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला कम्प्यूटेशनल टूल है, जो स्थिर परिसरों 9,10,11बनाने के दौरान अपने प्राथमिक बाध्यकारी मोड और समानता का पता लगाने के लिए प्रोटीन और लिगैंड की त्रि-आयामी संरचनाओं को नियोजित करता है। आणविक डॉकिंग प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग 1970 के दशक में उत्पन्न हुआ। लॉक और की पेयरिंग सिद्धांत के आधार पर और आणविक डॉकिंग सॉफ्टवेयर के एल्गोरिदम का उपयोग करके, कोई डॉकिंग परिणामों का विश्लेषण करके यौगिकों और आणविक लक्ष्यों के बीच बातचीत का निर्धारण कर सकता है। यह दृष्टिकोण यौगिक और लक्ष्य अणु दोनों के लिए सक्रिय बाध्यकारी साइटों की भविष्यवाणी को सक्षम बनाता है। नतीजतन, यह लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन के लिए एक इष्टतम बाध्यकारी रचना (यहां बाध्यकारी मॉडल कहा जाता है) की पहचान की सुविधा प्रदान करता है, जो इन आणविक व्यस्तताओं 12,13,14,15के यांत्रिकी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि आणविक डॉकिंग लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन के मूल्यवान कंप्यूटर-आधारित भविष्यवाणियां प्रदान करता है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये प्रारंभिक निष्कर्ष हैं। नतीजतन, इन इंटरैक्शन की पुष्टि करने के लिए आगे प्रयोगात्मक सत्यापन आवश्यक है।
सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (सीईटीएसए), जिसे शुरू में 2013 में पार नॉर्डलंड की शोध टीम द्वारा प्रस्तावित किया गया था, दवा-लक्ष्य प्रोटीन इंटरैक्शन को मान्य करने के लिए एक विधि के रूप में कार्य करता है। यह तकनीक विशेष रूप से दवा बंधन द्वारा प्रेरित लक्ष्य प्रोटीन की थर्मल स्थिरता का परीक्षण करती है, आणविक इंटरैक्शन 16,17,18की पुष्टि के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करती है। यह दृष्टिकोण मौलिक सिद्धांत पर आधारित है कि लिगैंड बाइंडिंग लक्ष्य प्रोटीन के भीतर एक थर्मल बदलाव शुरू करता है और सेल लाइसेट्स, बरकरार जीवित कोशिकाओं और19,20 ऊतकों सहित जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है। सीईटीएसए लिगैंड बाइंडिंग के कारण प्रोटीन के थर्मोडायनामिक स्थिरीकरण का पता लगाकर और लक्ष्य यौगिक 21,22के लिए मनाया फेनोटाइपिक प्रतिक्रिया को जोड़कर बरकरार कोशिकाओं में छोटे अणुओं के प्रत्यक्ष लक्ष्य सगाई का समर्थन करता है। CETSA से प्राप्त विभिन्न पद्धतियों में, वेस्टर्न ब्लॉट-सेट्सा (WB-CETSA) को एक शास्त्रीय दृष्टिकोण माना जाता है। सीईटीएसए विधि का उपयोग करके नमूना तैयार करने के बाद, लक्ष्य प्रोटीन की थर्मल स्थिरता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। यह सेलुलर सिस्टम17,23 के भीतर दवा प्रोटीन बातचीत के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देता है.
Xanthatin एक bioactive यौगिक संयंत्र Xanthium एल से अलग विरोधी भड़काऊ जैसे गुणों के साथ, जो पारंपरिक चीनी चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है नाक साइनसाइटिस और गठिया24,25 जैसी बीमारियों के इलाज के लिए है. केल्च की तरह ईसीएच से जुड़े प्रोटीन 1 (केएपी 1) कुलिन 3-आधारित कुलिन-रिंग ई 3 यूबिकिटिन लिगेज मल्टी-सबयूनिट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का एक घटक है और इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स होमियोस्टेसिस का एक महत्वपूर्ण नियामक है, जो इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स राज्य26 को संशोधित करके भड़काऊ प्रतिक्रिया की तीव्रता और अवधि को प्रभावित करता है। इस अध्ययन में, हमने पहले ज़ैंथटिन (छोटे अणु) और केएपी 1 प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए आणविक डॉकिंग का उपयोग किया, जिसका लक्ष्य उनके बाध्यकारी मोड की भविष्यवाणी करना था। इसके बाद, हमने Keap1 प्रोटीन की थर्मल स्थिरता पर xanthatin के प्रभाव का आकलन करके इस बातचीत को मान्य करने के लिए CETSA विधि को नियोजित किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोग लक्ष्यों की पहचान और दवाओं की खोज और विकास बारीकीसे जुड़े हुए हैं। सटीक विशिष्ट लक्ष्यों को लक्षित करके, दवा उम्मीदवारों को विशेष रोगों के इलाज के लिए और अधिक प्रभावी ढंग से विकसित किया जा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (82004031) और सिचुआन साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्रोग्राम (2022NSFSC1303) द्वारा समर्थित किया गया था। हम पश्चिमी धब्बा के साथ सहायता के लिए चीनी चिकित्सा और फार्मेसी के अभिनव संस्थान, पारंपरिक चीनी चिकित्सा के चेंगदू विश्वविद्यालय में जियायी सन के लिए अपनी महान प्रशंसा व्यक्त करते हैं।
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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