Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound(단백질 표적 예측 및 저분자 화합물의 검증)
Summary
여기에 사용된 실험은 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 세포 열 이동 분석과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.
Abstract
단백질은 인간 생리학의 근간을 이루며, 단백질의 표적은 연구 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 중요한 단백질 표적의 식별 및 검증은 약물 개발의 필수 요소가 되었습니다. 분자 도킹은 특히 약물 및 단백질 표적 상호 작용의 맥락에서 단백질-리간드 결합을 조사하는 데 널리 사용되는 계산 도구입니다. 결합의 실험적 검증을 위해 약물과 표적의 결합에 직접 접근하기 위해 세포 열 이동 분석(CETSA) 방법이 사용됩니다. 이 연구는 분자 도킹을 CETSA와 통합하여 약물과 필수 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 구체적으로, 분자 도킹 분석을 통해 xanthatin과 Keap1 단백질의 상호작용 및 결합 모드를 예측한 후 CETSA assay를 이용하여 상호작용을 검증하였습니다. 우리의 결과는 xanthatin이 Keap1 단백질의 특정 아미노산 잔기와 수소 결합을 형성하고 Keap1 단백질의 열안정성을 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 xanthatin이 Keap1 단백질과 직접 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다.
Introduction
단백질은 살아있는 유기체에서 매우 중요한 거대분자이며 막 구성, 세포골격 형성, 효소 활성, 수송, 세포 신호 전달, 세포 내 및 세포 외 메커니즘에 대한 관여와 같은 세포 내에서 다양한 고유 기능을 가지고 있습니다 1,2,3. 단백질은 주로 다른 단백질, 핵산, 소분자 리간드 및 금속 이온 1,4을 포함한 다양한 분자와의 특정 상호 작용을 통해 생물학적 기능을 나타냅니다. 리간드는 유기체의 단백질에 특이적으로 결합하는 작은 분자 화합물입니다. 단백질과 리간드 사이의 상호작용은 결합 부위(binding site)라고 불리는 단백질의 특정 부위에서 발생하며, 이는 결합 포켓(binding pocket)이라고도 한다5. 의약화화학 연구에서 초점은 약물의 표적 역할을 하는 질병과 명확하게 연관된 핵심 단백질을 식별하는 데 있다6. 따라서 단백질과 리간드 사이의 결합 부위에 대한 깊은 이해를 얻는 것은 약물 발견, 설계 및 연구를 촉진하는 데 가장 중요합니다 7,8.
분자 도킹은 단백질-리간드 결합을 연구하는 데 널리 사용되는 계산 도구로, 단백질과 리간드의 3차원 구조를 사용하여 안정적인 복합체를 형성할 때 주요 결합 모드와 친화도를 탐색합니다 9,10,11. 분자 도킹 기술의 적용은 1970년대에 시작되었습니다. lock and key pairing 원리를 기반으로 분자 도킹 소프트웨어의 알고리즘을 활용하여 도킹 결과를 분석하여 화합물과 분자 타겟 간의 상호 작용을 결정할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 화합물과 표적 분자 모두에 대한 활성 결합 부위를 예측할 수 있습니다. 결과적으로, 이는 리간드-수용체 상호 작용에 대한 최적의 결합 구조(여기서는 결합 모델이라고 함)의 식별을 용이하게 하며, 이는 이러한 분자 결합 12,13,14,15의 역학을 이해하는 데 중요합니다. 분자 도킹은 리간드-수용체 상호 작용에 대한 귀중한 컴퓨터 기반 예측을 제공하지만, 이는 예비 결과라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 이러한 상호 작용을 확인하기 위해 추가 실험적 검증이 필수적입니다.
2013년 Pär Nordlund의 연구팀이 처음 제안한 세포 열 이동 분석(CETSA)은 약물-표적 단백질 상호 작용을 검증하는 방법 역할을 합니다. 이 기술은 약물 결합에 의해 유도된 표적 단백질의 열적 안정성을 특이적으로 테스트하여 분자 상호 작용을 확인하기 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다 16,17,18. 이 접근법은 리간드 결합이 표적 단백질 내에서 열 이동을 시작한다는 기본 원리를 기반으로 하며 세포 용해물, 온전한 살아있는 세포 및 조직19,20을 포함한 광범위한 생물학적 샘플에 적용할 수 있습니다. CETSA는 리간드 결합으로 인한 단백질의 열역학적 안정화를 감지하고 관찰된 표현형 반응을 표적 화합물21,22에 연결하여 원형(intact) 세포에서 소분자의 직접적인 표적 결합을 지원합니다. CETSA에서 파생된 다양한 방법론 중 WB-CETSA(Western Blot-CETSA)는 고전적인 접근 방식으로 간주됩니다. CETSA 방법을 사용한 시료 전처리 후 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 표적 단백질의 열적 안정성 변화를 감지합니다. 이를 통해 세포 시스템 내에서 약물-단백질 상호 작용을 정확하게 결정할 수 있습니다17,23.
Xanthatin은 비강염 및 관절염과 같은 질병을 치료하기 위해 중국 전통 의학에서 사용되어 온 항염증제와 같은 특성을 가진 식물 Xanthium L.에서 분리된 생체 활성 화합물입니다24,25. 켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Keap1)은 Cullin3 기반 Cullin-RING E3 유비퀴틴 리가아제 다중 서브유닛 단백질 복합체의 구성 요소이며 세포 내 산화 환원 항상성의 중요한 조절자이며, 이는 세포 내 산화 환원 상태26을 조절하여 염증 반응의 강도와 지속 기간에 영향을 미칩니다. 이 연구에서는 먼저 분자 도킹을 활용하여 xanthatin(소분자)과 Keap1 단백질 간의 상호 작용을 조사하여 결합 모드를 예측하는 것을 목표로 했습니다. 그 후, CETSA 방법을 사용하여 Keap1 단백질의 열적 안정성에 대한 xanthatin의 영향을 평가함으로써 이러한 상호 작용을 검증했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
질병 표적의 식별과 약물의 발견 및 개발은 밀접하게 상호 연결되어 있습니다27. 특정 표적을 정확하게 표적으로 함으로써, 약물 후보는 약물과 관련된 부작용을 최소화하면서 동시에 특정 질병을 보다 효과적으로 치료하도록 개발될 수 있다(28,29). 가장 일반적으로 사용되는 표적은 단백질 표적30입니다. 그러나, 특?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82004031)과 쓰촨성 과학기술프로그램(Sichuan Science and Technology Program, 2022NSFSC1303)의 지원을 받았다. 웨스턴 블롯에 대한 도움을 주신 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy의 Jiayi Sun에게 큰 감사를 표합니다.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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