Summary

Прогнозирование белковых мишеней и валидация низкомолекулярного соединения

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Эксперимент, используемый здесь, показывает метод молекулярного докинга в сочетании с анализом клеточного теплового сдвига для прогнозирования и проверки взаимодействия между малыми молекулами и белковыми мишенями.

Abstract

Белки имеют фундаментальное значение для физиологии человека, а их мишени имеют решающее значение в исследованиях и разработке лекарств. Идентификация и валидация важнейших белковых мишеней стали неотъемлемой частью разработки лекарств. Молекулярный докинг — это вычислительный инструмент, широко используемый для исследования связывания белка с лигандом, особенно в контексте взаимодействия лекарств и белков-мишеней. Для экспериментальной проверки связывания и доступа к связыванию лекарственного препарата и его мишени непосредственно используется метод анализа клеточного теплового сдвига (CETSA). Это исследование было направлено на интеграцию молекулярного докинга с CETSA для прогнозирования и проверки взаимодействий между лекарствами и жизненно важными белковыми мишенями. В частности, мы предсказали взаимодействие между ксантатином и белком Keap1, а также способ его связывания с помощью молекулярного докингового анализа с последующей проверкой взаимодействия с помощью анализа CETSA. Наши результаты показали, что ксантатин может устанавливать водородные связи со специфическими аминокислотными остатками белка Keap1 и снижать термостабильность белка Keap1, что указывает на то, что ксантатин может напрямую взаимодействовать с белком Keap1.

Introduction

Белки являются очень важными макромолекулами в живых организмах и обладают разнообразным спектром уникальных функций в клетках, таких как состав мембраны, формирование цитоскелета, активность ферментов, транспорт, клеточная сигнализация и участие как во внутриклеточных, так и во внеклеточныхмеханизмах. Белки проявляют свои биологические функции в основном через специфические взаимодействия с различными молекулами, включая другие белки, нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные лиганды и ионы металлов 1,4. Лиганды — это небольшие молекулярные соединения, которые специфически связываются с белками в организме. Взаимодействие между белками и лигандами происходит в определенных участках белка, называемых сайтами связывания, также известными как карманы связывания5. В исследованиях медицинской химии основное внимание уделяется выявлению ключевых белков, которые явно связаны с заболеваниями, которые служат мишенями для лекарств6. Таким образом, получение глубокого понимания сайтов связывания между белками и лигандами имеет первостепенное значение для содействия открытию, разработке и исследованию лекарств 7,8.

Молекулярный докинг является широко используемым вычислительным инструментом для изучения связывания белка с лигандом, который использует трехмерные структуры белков и лигандов для изучения их первичных способов связывания и сродства при образовании стабильных комплексов 9,10,11. Применение технологии молекулярного докинга зародилось в 1970-х годах. Основываясь на принципе спаривания замка и ключа и используя алгоритмы программного обеспечения молекулярного докинга, можно определить взаимодействие между соединениями и молекулярными мишенями, анализируя результаты докинга. Этот подход позволяет предсказывать активные сайты связывания как для соединения, так и для молекулы-мишени. Следовательно, это облегчает идентификацию оптимальной конформации связывания (здесь называемой моделью связывания) для лиганд-рецепторных взаимодействий, что имеет решающее значение для понимания механики этих молекулярных взаимодействий 12,13,14,15. Хотя молекулярный докинг обеспечивает ценные компьютерные предсказания лиганд-рецепторных взаимодействий, важно отметить, что это предварительные результаты. Следовательно, для подтверждения этих взаимодействий необходима дальнейшая экспериментальная проверка.

Анализ клеточного теплового сдвига (CETSA), первоначально предложенный исследовательской группой Pär Nordlund в 2013 году, служит методом проверки взаимодействий белков между лекарствами и мишенями. Этот метод специально проверяет термическую стабильность белков-мишеней, индуцированных связыванием лекарственного средства, обеспечивая практический подход к подтверждению молекулярных взаимодействий 16,17,18. Этот подход основан на фундаментальном принципе, согласно которому связывание лиганда инициирует тепловой сдвиг внутри белков-мишеней, и применимо к широкому спектру биологических образцов, включая клеточные лизаты, интактные живые клетки и ткани19,20. CETSA поддерживает прямое поражение малых молекул в интактных клетках, обнаруживая термодинамическую стабилизацию белков из-за связывания лигандов и связывая наблюдаемый фенотипический ответ с целевым соединением21,22. Среди различных методологий, заимствованных из CETSA, классический подход считается Western Blot-CETSA (WB-CETSA). После подготовки образца с использованием метода CETSA используется вестерн-блоттинг для обнаружения изменений в термической стабильности целевого белка. Это позволяет точно определять лекарственно-белковые взаимодействия в клеточных системах 17,23.

Ксантатин — это биологически активное соединение, выделенное из растения Xanthium L. с такими противовоспалительными свойствами, которое используется в традиционной китайской медицине для лечения таких заболеваний, как синусит носа и артрит. Келх-подобный ECH-ассоциированный белок 1 (Keap1) является компонентом мультисубъединичного белкового комплекса убиквитинлигазы E3 на основе Cullin3 и важным регулятором внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, который влияет на интенсивность и продолжительность воспалительной реакции путем модуляции внутриклеточного окислительно-восстановительного состояния26. В этом исследовании мы впервые использовали молекулярный докинг для изучения взаимодействия между ксантатином (малой молекулой) и белком Keap1 с целью прогнозирования их способа связывания. Впоследствии мы использовали метод CETSA для подтверждения этого взаимодействия, оценив влияние ксантатина на термическую стабильность белка Keap1.

Protocol

1. Загрузка структур ксантатина и Keap1 Откройте базу данных PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), введите ксантатин (малую молекулу), затем нажмите «Поиск » и нажмите « Первый результат». Нажмите « Загрузить» и нажмите «Сохранить в 2D-структуре», чтобы …

Representative Results

Молекулярный докинг-анализ предсказал взаимодействие между ксантатином и белком Keap1. На рисунке 2 показано образование водородных связей между ксантатином и аминокислотными остатками Gly-367 и Val-606 белка Keap1 с длиной водородной связи 2,17 Å для Gly-367 и 2,13 Å для Val-606. Кроме того, …

Discussion

Идентификация мишеней болезней и открытие и разработка лекарств тесно взаимосвязаны27. Точно нацеливаясь на конкретные мишени, можно разработать лекарственные препараты-кандидаты для более эффективного лечения конкретных заболеваний, одновременно минимизируя побочные …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82004031) и Сычуаньской научно-технической программой (2022NSFSC1303). Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении вестерн-блоттинга.

Materials

0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane Millipore PR05509
Anhydrous ethanol Chron chemicals 64-17-5
Bovine serum albumin BioFroxx 4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures Boster Biological Technology Co., Ltd AR1193
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent Beyotime Biotechnology Co., Ltd P0018S
GAPDH antibody ProteinTech Group Co., Ltd 10494-1-AP
Gel Imaging Instrument E-BLOT Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument Biometra TADVANCED Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody ProteinTech Group Co., Ltd SA00001-2
Isopropyl alcohol  Chron chemicals 67-63-0
Keap1 antibody Zen BioScience Co., Ltd R26935
Metal bath Analytik Jena TSC
Methanol Chron chemicals 67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×) NCM Biotech Co., Ltd WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie Epizyme Biotech Co., Ltd PG212
Phosphate buffer saline Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0021
Prestained Color Protein Marker Biosharp  BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System Bio-Rad MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell Beyotime Biotechnology Co., Ltd C7505
RAW264.7 cell-specific medium Procell Life Science&Technology Co., Ltd CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer Boster Biological Technology Co., Ltd AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018
Tris buffered saline powder Servicebio G0001
Tween 20 BioFroxx 1247ML100
Water bath Memmert WNE10
Water purifier Millipore Milli- IQ 7005
Xanthatin ChemConst Biotechnology Co., Ltd CONST210706

References

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Play Video

Cite This Article
Luo, L., Xiong, J., Tang, Y., Chen, X., Zhang, H. Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound. J. Vis. Exp. (204), e66564, doi:10.3791/66564 (2024).

View Video