小分子化合物的蛋白质靶点预测与验证
Summary
这里使用的实验展示了一种分子对接结合细胞热位移测定的方法，以预测和验证小分子和蛋白质靶标之间的相互作用。
Abstract
蛋白质是人体生理学的基础，其靶点在研究和药物开发中至关重要。关键蛋白质靶标的识别和验证已成为药物开发不可或缺的一部分。分子对接是一种广泛用于研究蛋白质-配体结合的计算工具，特别是在药物和蛋白质靶标相互作用的背景下。为了进行结合的实验验证并直接获得药物与其靶标的结合，使用细胞热位移测定 （CETSA） 方法。本研究旨在将分子对接与CETSA相结合，以预测和验证药物与重要蛋白质靶点之间的相互作用。具体来说，我们通过分子对接分析预测了xanthatin和Keap1蛋白之间的相互作用及其结合模式，然后使用CETSA法验证了该相互作用。结果表明，黄素可以与Keap1蛋白的特定氨基酸残基建立氢键，降低Keap1蛋白的热稳定性，表明黄素可以直接与Keap1蛋白相互作用。
Introduction
蛋白质是生物体中非常重要的大分子，在细胞内具有多种独特的功能，例如膜组成、细胞骨架形成、酶活性、运输、细胞信号传导以及参与细胞内和细胞外机制 1,2,3。蛋白质主要通过与多种分子的特异性相互作用来表现出其生物学功能，包括其他蛋白质、核酸、小分子配体和金属离子 1,4。配体是与生物体中的蛋白质特异性结合的小分子化合物。蛋白质和配体之间的相互作用发生在蛋白质上的特定位点，称为结合位点，也称为结合口袋5。在药物化学研究中，重点在于识别与疾病明显相关的关键蛋白质，这些蛋白质是药物的靶标6。因此，深入了解蛋白质和配体之间的结合位点对于促进药物发现、设计和研究至关重要7,8。
分子对接是一种广泛使用的用于研究蛋白质-配体结合的计算工具，它利用蛋白质和配体的三维结构来探索它们在形成稳定复合物时的主要结合模式和亲和力9,10,11。分子对接技术的应用起源于1970年代。基于锁键配对原理，利用分子对接软件的算法，通过分析对接结果，可以确定化合物与分子靶标之间的相互作用。这种方法可以预测化合物和靶分子的活性结合位点。因此，它有助于识别配体-受体相互作用的最佳结合构象（此处称为结合模型），这对于理解这些分子结合的机制至关重要 12,13,14,15。虽然分子对接提供了有价值的基于计算机的配体-受体相互作用预测，但重要的是要注意这些是初步发现。因此，进一步的实验验证对于确认这些相互作用至关重要。
细胞热位移测定 （CETSA） 最初由 Pär Nordlund 的研究团队于 2013 年提出，是一种验证药物-靶蛋白相互作用的方法。该技术专门测试药物结合诱导的靶蛋白的热稳定性，为确认分子相互作用提供了一种实用的方法16,17,18。这种方法基于配体结合在靶蛋白内启动热位移的基本原理，适用于各种生物样品，包括细胞裂解物、完整活细胞和组织19,20。CETSA 通过检测由于配体结合导致的蛋白质热力学稳定性并将观察到的表型反应与目标化合物联系起来，支持完整细胞中小分子的直接靶向参与21,22。在源自 CETSA 的各种方法中，Western Blot-CETSA （WB-CETSA） 被认为是一种经典方法。在使用 CETSA 方法制备样品后，使用蛋白质印迹分析来检测靶蛋白热稳定性的变化。这使得可以精确测定细胞系统内的药物-蛋白质相互作用17,23。
Xanthatin 是从植物 Xanthium L. 中分离出的一种生物活性化合物，具有抗炎等特性，在中医中已用于治疗鼻窦炎和关节炎等疾病24,25。Kelch 样 ECH 相关蛋白 1 （Keap1） 是基于 Cullin3 的 Cullin-RING E3 泛素连接酶多亚基蛋白复合物的组成部分，也是细胞内氧化还原稳态的重要调节因子，它通过调节细胞内氧化还原状态来影响炎症反应的强度和持续时间26。在这项研究中，我们首先利用分子对接来研究xanthatin（小分子）与Keap1蛋白之间的相互作用，旨在预测它们的结合模式。随后，我们采用 CETSA 方法通过评估 xanthatin 对 Keap1 蛋白热稳定性的影响来验证这种相互作用。
Protocol
1. 下载 xanthatin 和 Keap1 的结构 打开 PubChem 数据库 （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），输入 xanthatin（小分子），然后按 搜索并单击 第一个结果。单击“ 下载 ”，然后单击“2D结构”下的“ 保存 ”，以.sdf格式保存化合物。 下载蛋白质的晶体结构。打开 UniProt 数据库 （https://www.uniprot.org/），输入 Keap1 并点击搜…
Representative Results
分子对接分析预测了黄素与Keap1蛋白之间的相互作用。 图 2 显示了 xanthatin 与 Keap1 蛋白的氨基酸残基 Gly-367 和 Val-606 之间形成氢键，Gly-367 的氢键长度为 2.17 Å，Val-606 的氢键长度为 2.13 Å。此外，计算出的对接分数为 -5.69 kcal/mol 表明 xanthatin 和 Keap1 蛋白之间具有良好的结合亲和力。 CETSA方法显示，黄素结合改变了Keap1蛋白的热稳定性，证实了黄素与Keap1?…
Discussion
疾病靶点的确定与药物的发现和开发密切相关27.通过精确靶向特定靶点，可以开发候选药物以更有效地治疗特定疾病，同时最大限度地减少与药物相关的副作用28,29。最常用的靶标是蛋白质靶标30。然而，由于细胞内蛋白质的广泛多样性，特殊蛋白质靶标的鉴定带来了巨大的挑战30,31<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（82004031）和四川省科技计划（2022NSFSC1303）的支持。我们非常感谢成都中医药大学中药创新研究所的孙佳怡在蛋白质印迹方面的帮助。
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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Cite This Article
Luo, L., Xiong, J., Tang, Y., Chen, X., Zhang, H. Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound. J. Vis. Exp. (204), e66564, doi:10.3791/66564 (2024).