Prediktion och validering av proteinmål för småmolekylära föreningar
Summary
Experimentet som används här visar en metod för molekylär dockning i kombination med cellulär termisk skiftanalys för att förutsäga och validera interaktionen mellan små molekyler och proteinmål.
Abstract
Proteiner är grundläggande för människans fysiologi, och deras måltavlor är avgörande inom forskning och läkemedelsutveckling. Identifiering och validering av viktiga proteinmål har blivit en integrerad del av läkemedelsutvecklingen. Molekylär dockning är ett beräkningsverktyg som används i stor utsträckning för att undersöka bindning av proteiner, särskilt i samband med interaktioner mellan läkemedel och proteinmål. För den experimentella verifieringen av bindningen och för att få direkt tillgång till bindningen av läkemedlet och dess mål, används metoden cellulär termisk skiftanalys (CETSA). Denna studie syftade till att integrera molekylär dockning med CETSA för att förutsäga och validera interaktioner mellan läkemedel och vitala proteinmål. Specifikt förutspådde vi interaktionen mellan xanthatin och Keap1-protein samt dess bindningssätt genom molekylär dockningsanalys, följt av verifiering av interaktionen med hjälp av CETSA-analysen. Våra resultat visade att xanthatin kunde etablera vätebindningar med specifika aminosyrarester av Keap1-protein och minska termostabiliteten hos Keap1-proteinet, vilket indikerar att xanthatin direkt kan interagera med Keap1-proteinet.
Introduction
Proteiner är mycket viktiga makromolekyler i levande organismer och har en mängd unika funktioner i celler, såsom membransammansättning, cytoskelettbildning, enzymaktivitet, transport, cellsignalering och engagemang i både intracellulära och extracellulära mekanismer 1,2,3. Proteiner manifesterar sina biologiska funktioner främst genom specifika interaktioner med en mängd olika molekyler, inklusive andra proteiner, nukleinsyror, småmolekylära ligander och metalljoner 1,4. Ligander är små molekylära föreningar som specifikt binder till proteiner i en organism. Interaktionen mellan proteiner och ligander sker på specifika platser på proteinet, så kallade bindningsställen, även kända som bindningsfickorna5. Inom läkemedelskemisk forskning ligger fokus på att identifiera nyckelproteiner som är tydligt associerade med sjukdomar, som fungerar som måltavlor för läkemedel6. Därför är det av yttersta vikt att få en djup förståelse för bindningsställena mellan proteiner och ligander för att främja läkemedelsupptäckt, design och forskning 7,8.
Molekylär dockning är ett allmänt använt beräkningsverktyg för att studera protein-ligandbindning, som använder de tredimensionella strukturerna av proteiner och ligander för att utforska deras primära bindningssätt och affiniteter när de bildar stabila komplex 9,10,11. Tillämpningen av molekylär dockningsteknik har sitt ursprung på 1970-talet. Baserat på principen om lås och nyckel-parning och med hjälp av algoritmerna för molekylär dockningsprogramvara kan man bestämma interaktionen mellan föreningar och molekylära mål genom att analysera dockningsresultat. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att förutsäga aktiva bindningsställen för både föreningen och målmolekylen. Följaktligen underlättar det identifieringen av en optimal bindningskonformation (här kallad bindningsmodellen) för ligand-receptorinteraktioner, vilket är avgörande för att förstå mekaniken bakom dessa molekylära engagemang 12,13,14,15. Även om molekylär dockning ger värdefulla datorbaserade förutsägelser av ligand-receptorinteraktioner, är det viktigt att notera att detta är preliminära resultat. Följaktligen är ytterligare experimentell verifiering nödvändig för att bekräfta dessa interaktioner.
Cellular thermal shift assay (CETSA), som ursprungligen föreslogs av Pär Nordlunds forskargrupp 2013, fungerar som en metod för att validera interaktioner mellan läkemedel och målproteiner. Denna teknik testar specifikt den termiska stabiliteten hos målproteiner inducerade av läkemedelsbindning, vilket ger ett praktiskt tillvägagångssätt för att bekräfta molekylära interaktioner 16,17,18. Detta tillvägagångssätt är baserat på den grundläggande principen att ligandbindning initierar en termisk förändring inom målproteiner och är tillämpbar på ett brett spektrum av biologiska prover, inklusive celllysat, intakta levande celler och vävnader19,20. CETSA stöder direkt målengagemang av små molekyler i intakta celler genom att detektera termodynamisk stabilisering av proteiner på grund av ligandbindning och koppla det observerade fenotypiska svaret till målföreningen21,22. Bland de olika metoder som härrör från CETSA anses Western Blot-CETSA (WB-CETSA) vara en klassisk metod. Efter provberedning med hjälp av CETSA-metoden används western blot-analys för att detektera förändringar i den termiska stabiliteten hos målproteinet. Detta möjliggör en exakt bestämning av läkemedels-proteininteraktioner inom cellulära system17,23.
Xanthatin är en bioaktiv förening isolerad från växten Xanthium L. med egenskaper som antiinflammatorisk, som har använts i traditionell kinesisk medicin för att behandla sjukdomar som näsbihåleinflammation och artrit24,25. Det kelch-liknande ECH-associerade proteinet 1 (Keap1) är en komponent i det Cullin3-baserade Cullin-RING E3 ubiquitin-ligaset multi-subunit proteinkomplexet och en viktig regulator av intracellulär redoxhomeostas, som påverkar intensiteten och varaktigheten av det inflammatoriska svaret genom att modulera det intracellulära redoxtillståndet26. I den här studien använde vi först molekylär dockning för att undersöka interaktionen mellan xanthatin (liten molekyl) och Keap1-proteinet, i syfte att förutsäga deras bindningssätt. Därefter använde vi CETSA-metoden för att validera denna interaktion genom att bedöma effekten av xanthatin på den termiska stabiliteten hos Keap1-proteinet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifieringen av sjukdomsmål och upptäckten och utvecklingen av läkemedel är nära förbundna med varandra27. Genom att rikta in sig på specifika måltavlor kan läkemedelskandidater utvecklas för att behandla vissa sjukdomar mer effektivt samtidigt som de biverkningar som är förknippade med läkemedlenminimeras 28,29. De vanligaste målen är protein targets30. Identifieringen av speciella proteinmål utg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82004031) och Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Vi uttrycker vår stora uppskattning till Jiayi Sun vid Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, för hjälpen med western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
