Directe microbiële identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem om de EUCAST RAST-methode zonder massaspectrometrie te vergemakkelijken

Summary

EUCAST heeft een protocol voor directe antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) ontwikkeld voor geautomatiseerde bloedculturen. De afhankelijkheid van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie kan echter worden vermeden door gebruik te maken van een direct protocol voor de bereiding van inoculum in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Deze aanpak kan AST-rapporten opleveren binnen 24 uur na monsterafname.

Abstract

Gramnegatieve (GN) sepsis is een medisch noodgeval waarbij de behandeling in omgevingen met beperkte middelen berust op conventionele microbiologische kweektechnieken, wat binnen 3-4 dagen resultaten oplevert. Zowel EUCAST als CLSI erkennen deze vertraging in de doorlooptijd (TAT) en hebben protocollen ontwikkeld voor het bepalen van AST-resultaten rechtstreeks uit positief gemarkeerde geautomatiseerde bloedkweekflessen (+aBC’s). Het EUCAST rapid AST (RAST)-protocol werd voor het eerst geïntroduceerd in 2018, waarbij breekpunten in de zonediameter voor vier veel voorkomende etiologische agentia van GN-sepsis, namelijk Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii-complex , kunnen worden gerapporteerd. De klinische laboratoria die deze methode in hun routinematige workflow hebben geïmplementeerd, vertrouwen echter op microbiële identificatie op basis van massaspectrometrie, die niet gemakkelijk beschikbaar is, waardoor de implementatie ervan in omgevingen met beperkte middelen wordt uitgesloten. Om dit te omzeilen, evalueerden we een direct inoculumprotocol (DIP) met behulp van een commercieel geautomatiseerd microbieel identificatie- en antimicrobieel gevoeligheidstestsysteem (aMIAST) om vroege microbiële identificatie mogelijk te maken binnen 8 uur na positieve markering van aBC. We hebben dit protocol van januari tot oktober 2023 geëvalueerd om de vier RAST-rapporteerbare GN (RR-GN) in de positief gemarkeerde aBC te identificeren. De microbiële identificatieresultaten in DIP werden vergeleken met het standaard inoculumvoorbereidingsprotocol (SIP) in aMIAST. Van de 204 +aBC’s met monomorfe GN (+naBC) werd één van de 4 RR-GN geïdentificeerd in 105 +naBC’s door SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 en A. baumannii complex: 26). Hiervan werd 94% (98/105) correct geïdentificeerd door DIP, terwijl de percentages grote fouten en zeer grote fouten respectievelijk 6% (7/105) en 1,7% (4/240) bedroegen. Wanneer DIP voor microbiële identificatie wordt uitgevoerd met behulp van de EUCAST RAST-methode, kunnen binnen 24 uur na ontvangst van het monster voorlopige klinische rapporten worden verstrekt. Deze aanpak heeft het potentieel om de TAT aanzienlijk te verminderen, waardoor een vroege instelling van geschikte antimicrobiële therapie mogelijk wordt.

Introduction

Sepsis, een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem, wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie als gevolg van een ontregelde reactie van de gastheer op infectie. De Global Burden of Diseases Study schatte dat er in 2017 wereldwijd 48,9 miljoen gevallen van sepsis en 11 miljoen sepsisgerelateerde sterfgevallen waren, wat goed was voor bijna 20% van^{alle wereldwijde} sterfgevallen. Ongeveer 2/3^e van de bloedbaaninfecties (BSI) die sterfte veroorzaken, is te wijten aan gramnegatieve bacteriële pathogenen². De belangrijkste doodsoorzaken onder gramnegatieven (GN) zijn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii, die ongeveer 40% van de gevallen uitmaken onder 33 bacteriële^pathogenen.

Bloedculturen blijven de gouden standaard voor het diagnosticeren van BSI, en snelle microbiële identificatie samen met de resultaten van antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) is de sleutel tot behandeling. Er wordt geschat dat de kans op sterfte met 9% toeneemt met elke uur vertraging bij het instellen van geschikte antimicrobiële stoffen bij sepsis³. De doorlooptijd (TAT) van microbiologisch positieve bloedkweekrapporten met AST-resultaten is ongeveer 48-72 uur met de beschikbare microbiologische hulpmiddelen in omgevingen met beperkte middelen, zelfs met geautomatiseerde systemen. Als gevolg van deze ondermaatse TAT worden breedspectrum antimicrobiële stoffen empirisch gebruikt, wat bijdraagt aan het ontluikende probleem van antimicrobiële resistentie (AMR). EUCAST en CLSI erkennen deze dringende noodzaak om TAT voor microbiologische kweektechnieken voor sepsis te verminderen en evolueren naar het rechtstreeks uitvoeren van ASAT uit positief gemarkeerde bloedkweekflessen (+aBC)^4,5.

In 2018 introduceerde EUCAST voor het eerst de snelle ASAT (RAST)-methode voor het bepalen van ASAT door middel van de Kirby-Bauer-schijfdiffusiemethode bij korte incubatietijden, d.w.z. 4 uur, 6 uur en 8 uur, rechtstreeks vanaf +aBC ^6,7. De methode is momenteel gevalideerd voor het bepalen van ASAT voor +aBC’s die een van de 8 meest voorkomende oorzaken van BSI bevatten, namelijk E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii-complex onder gramnegatieven en Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium en Streptococcus pneumoniae onder grampositieven⁸. De breekpunten voor AST-bepaling met verschillende tijdsintervallen worden verstrekt volgens de hierboven genoemde microbiële soorten. Daarom is microbiële identificatie noodzakelijk voordat AST-resultaten categorisch worden geïnterpreteerd. De RAST-standaard specificeert echter niet de methode om microbiële identificatie binnen dit tijdsbestek mogelijk te maken.

In de meeste studies die de EUCAST RAST-methode in hun setting evalueerden, werd gebruik gemaakt van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie na korte incubatie op vergulde media om micro-organismen te identificeren 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Massaspectrometrie-instrumenten zijn echter niet overal beschikbaar, vooral niet in lage- tot middeninkomenslanden (LMIC’s), wat het potentiële nut van deze methode sterk beperkt. Weinig studies hebben de implementatie van deze methode in hun centra gemeld zonder gebruik te maken van massaspectrometrie 18,19,20. Tayşi et ^al.18 rapporteerden een brede categorisering van GN onder Enterobacterales, Pseudomonas en Acinetobacter spp. op basis van gramkleuringsmorfologie en oxidasetest voordat de AST-resultaten werden geïnterpreteerd. In andere studies van dit centrum, door Gupta et ^al.19 en Siddiqui et ^al.20, werd microbiële identificatie op soortniveau gedaan door een bacteriepellet te bereiden uit het positief gemarkeerde bloedbouillonmengsel en deze te inoculeren op de conventionele biochemische tests. Hoewel Tayşi et ^al.18 geen commentaar gaven op de nauwkeurigheid van microbiële identificatie met hun benadering, rapporteerden Gupta et ^al.19 dat met hun benadering in 165/176 (94%) gevallen, een RAST-rapporteerbare gramnegatief (RR-GN), d.w.z. een van E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii complex. Met de laatste benadering werd het lezen van RAST-resultaten echter retrospectief gedaan met behulp van breekpunten met een zonediameter van 8 uur, pas na de volledige incubatie van conventionele biochemische resultaten, d.w.z. 18-24 uur na inoculatie, en de gemiddelde tijd voor rapportage was ongeveer 2 dagen.

Om de TAT van klinische rapporten verder te verminderen, stellen we een alternatieve methodologie voor om vroege identificatie van GN aanwezig in +aBC’s mogelijk te maken met behulp van aMIAST. Vóór de introductie van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatiesystemen, werden deze geautomatiseerde identificatiesystemen beschouwd als de zorgstandaard voor microbiële identificatie, waarbij identificatie mogelijk werd gemaakt door colorimetrische en/of fluorometrische veranderingen die werden geïnduceerd door testbacteriën wanneer ze werden geïnoculeerd in geminiaturiseerde biochemische tests die in een cassette werden bewaard en de resultaten matchten met hun isolaatdatabase. De gemiddelde tijd tot identificatie in deze systemen is ongeveer 4 uur tot 8 uur, maar ze worden beperkt door het feit dat de fabrikanten aanbevelen om microben ‘s nachts te laten groeien voordat hun respectieve identificatiekaarten kunnen worden geïnoculeerd. Deze vereiste beperkt hun bruikbaarheid bij het verkorten van de tijd om te rapporteren aanzienlijk.

Er zijn maar weinig studies die methoden hebben geëvalueerd om microben van +aBC’s direct te identificeren met behulp van deze geautomatiseerde systemen 21,22,23,24,25,26,27. In het geval van +aBC’s die monomorfe GN bevatten, toonden de meeste onderzoeken een uitstekende overeenstemming aan tussen directe inoculatie uit bacteriële pellets gemaakt van een positief bloedbouillonmengsel en standaard kolonie-incubatie. In het geval van grampositieven waren de concordantiepercentages echter suboptimaal. Aangezien de gemiddelde tijd tot positiviteit van +aBC’s tussen 8 uur en 16 uur ligt en de identificatie van GN ~4 uur tot 8 uur duurt in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem, veronderstellen we dat door gebruik te maken van een direct inoculatieprotocol bij de geautomatiseerde microbiële identificatie, we de klinische rapportage van +aBC’s met GN met een RR-GN binnen 24 uur na monsterontvangst kunnen voltooien.

Setting voor de studie
De huidige studie werd van januari tot oktober 2023 uitgevoerd in het klinische bacteriologisch laboratorium van een academisch instituut voor tertiaire zorg van nationaal belang (INI) met 950 bedden in Centraal-India. Het laboratorium is uitgerust met een continu bloedkweek monitoring systeem (CBCMS) en aMIAST. Het bacteriologisch laboratorium is de klok rond functioneel met de beschikbaarheid van technici en microbiologen voor het verwerken en rapporteren van elk positief gemarkeerd bloedkweekflesje (+aBC’s).

Microbiële methoden die hier worden gebruikt
De workflow van het onderzoek is weergegeven in figuur 1. De +aBC’s die monomorfe GN’s (+naBC) vertonen, werden verwerkt door directe inoculatie van overeenkomstige identificatiekaarten om identificatie en AST mogelijk te maken met behulp van het EUCAST RAST-protocol. Deze resultaten werden vergeleken met de standaardbehandeling (SoC) methode voor +aBC’s, d.w.z. subcultuur op conventionele vergulde media door middel van schapenbloedagar (SBA), chocolade-agar (CA) en MacConkey-agar (MA), aëroob geïncubeerd gedurende 16 uur tot 24 uur, gevolgd door identificatie- en AST-kaarten gegeven door aMIAST wanneer geïsoleerde kolonies verschijnen. Bloedculturen die grampositieve kokken, grampositieve bacillen, ontluikende gistcellen en ≥2 verschillende micro-organismen op initiële gramkleuring of vergulde media vertoonden, werden uitgesloten van het onderzoek.

Protocol

De studie, gefinancierd door de intramurale onderzoekssubsidie die door AIIMS Bhopal aan Dr. Ayush Gupta werd gegeven, werd goedgekeurd door de Institutional Human Ethics Committee (IHEC) vide letter nr: IHEC-LOP/2022/IL072. OPMERKING: Er werd een monstervolume van 5 ml gebruikt op basis van studies uitgevoerd door Quesada et al.25 en Munoz-Davila et al.27. 1. Standaard inoculumprotocol (SIP) voor bacteriële ide…

Representative Results

Algemene resultatenTijdens de onderzoeksperiode ondergingen 240 +naBC’s identificatie door aMIAST met behulp van zowel DIP als SIP. Hiervan bleek 15% (36/240) +naBC’s polymicrobieel te zijn na nachtelijke incubatie op de vergulde media. Van de 204 +naBC’s bedroeg het door SIP geïdentificeerde aandeel RR-GN 51,5% (105/204). Van hen was 47,6% (50/105) E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa en 24,8% (26/105) A. baumannii-complex . Een gedetai…

Discussion

Met behulp van DIP zijn we erin geslaagd de RR-GN’s te identificeren met een aanzienlijke diagnostische nauwkeurigheid. De gemiddelde TTI na positieve markering van aBC was slechts 507 min (~ 8,5 uur). Wanneer het dus wordt gedaan in combinatie met de EUCAST RAST-methode voor AST-bepaling, kan het isolaatidentificatie geven bij een AST-leestijd van 8 uur. Deze aanpak heeft het potentieel om de EUCAST RAST-methode te implementeren, waardoor identificatie op basis van massaspectrometrie overbodig wordt. Dit is een zegen vo…

Materials

ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli