Прямая микробная идентификация с помощью автоматизированной системы микробной идентификации для упрощения метода EUCAST RAST без масс-спектрометрии

Summary

Компания EUCAST разработала протокол прямого тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для автоматизированного посева крови. Тем не менее, его зависимость от идентификации микроорганизмов на основе масс-спектрометрии может быть устранена путем использования протокола прямой подготовки инокулюма в автоматизированной системе идентификации микроорганизмов. Такой подход позволяет получать отчеты AST в течение 24 часов после сбора пробы.

Abstract

Грамотрицательный сепсис (ГН) – это неотложная медицинская ситуация, при которой лечение в условиях ограниченных ресурсов основано на традиционных методах микробиологического культивирования, обеспечивающих результаты в течение 3-4 дней. Признавая эту задержку во времени обработки (TAT), EUCAST и CLSI разработали протоколы для определения результатов AST непосредственно из автоматически помеченных флаконов для посева крови (+aBCs). Протокол EUCAST rapid AST (RAST) был впервые представлен в 2018 году, в котором можно сообщить о точках разрыва диаметра зоны для четырех распространенных этиологических агентов сепсиса GN, т.е. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и комплекса Acinetobacter baumannii . Тем не менее, те клинические лаборатории, которые внедрили этот метод в свой повседневный рабочий процесс, полагаются на микробную идентификацию на основе масс-спектрометрии, которая не всегда доступна, что исключает ее применение в условиях ограниченных ресурсов. Чтобы обойти его, мы оценили протокол прямого инокулята (DIP) с использованием коммерческой автоматизированной системы идентификации микроорганизмов и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (aMIAST), чтобы обеспечить раннюю идентификацию микроорганизмов в течение 8 часов после положительной маркировки aBC. Мы оценили этот протокол с января по октябрь 2023 года, чтобы определить четыре ГН, О КОТОРЫХ МОЖНО БЫЛО БЫ СООБЩИТЬ ПО RAST (RR-GN) в положительно отмеченном aBC. Результаты микробной идентификации в DIP сравнивали со стандартным протоколом приготовления инокулюма (SIP) в aMIAST. Из 204 +aBC с мономорфным GN (+naBC) один из 4 RR-GN был идентифицирован в 105 +naBC с помощью SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 и комплекс A. baumannii : 26). Из них 94% (98 из 105) были правильно идентифицированы с помощью DIP, в то время как частота серьезных и очень серьезных ошибок составила 6% (7 из 105) и 1,7% (4 из 240) соответственно. Если DIP для идентификации микроорганизмов проводится с использованием метода EUCAST RAST, предварительные клинические отчеты могут быть предоставлены в течение 24 часов после получения образца. Этот подход обладает потенциалом для значительного снижения ТАТ, что позволяет на ранних этапах начать соответствующую антимикробную терапию.

Introduction

Сепсис, важная глобальная проблема здравоохранения, определяется как опасная для жизни дисфункция органов из-за нерегулируемой реакции организма на инфекцию. По оценкам исследования «Глобальное бремя болезней», в 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, связанных с сепсисом, что составляет почти 20% всех случаев смерти в^мире1. Около 2/3 инфекций кровотока (BSI), вызывающих смертность, вызваны грамрицательными бактериальными патогенами². Ведущими причинами смертности среди грамотрицательных организмов (ГН) являются Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, на долю которых приходится около 40% случаев среди 33 бактериальных патогенов².

Бактериологическое исследование крови остается золотым стандартом для диагностики BSI, а быстрая микробная идентификация наряду с результатами тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) является ключом к лечению. Было подсчитано, что при сепсисе³ вероятность смертности увеличивается на 9% с каждым часом задержки в назначении соответствующих противомикробных препаратов. Время обработки (ТАТ) микробиологически положительных отчетов о посеве крови с результатами АСТ составляет около 48-72 ч при использовании микробиологических инструментов в условиях ограниченных ресурсов, даже при использовании автоматизированных систем. В результате такого некачественного ТАТ противомикробные препараты широкого спектра действия используются эмпирически, что способствует растущей проблеме устойчивости к противомикробным препаратам (УПП). Признавая эту острую необходимость снижения TAT для методов микробиологического культивирования сепсиса, EUCAST и CLSI переходят к проведению AST непосредственно из флаконов с положительной маркировкой для посева крови (+aBC)^4,5.

В 2018 году EUCAST впервые представила метод быстрого AST (RAST) для определения AST по дисковому диффузионному методу Кирби-Бауэра при коротком времени инкубации, т.е. 4 ч, 6 ч и 8 ч, непосредственно от +aBC ^6,7. В настоящее время метод валидирован для определения АСТ для +aBC, содержащих одну из 8 наиболее распространенных причин BSI, а именно E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и комплекс A. baumannii среди грамотрицательных и Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium и Streptococcus pneumoniae среди грамположительных⁸. Контрольные точки для определения AST в различные временные интервалы приведены в соответствии с перечисленными выше видами микроорганизмов. Следовательно, прежде чем категорически интерпретировать результаты АСТ, необходима микробная идентификация. Однако в стандарте RAST не указан метод, позволяющий проводить идентификацию микроорганизмов в течение этого периода времени.

В большинстве исследований, в которых оценивали метод EUCAST RAST, использовалась микробная идентификация на основе масс-спектрометрии после короткой инкубации на покрытых средах для идентификации микроорганизмов 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Тем не менее, инструменты масс-спектрометрии не являются широко доступными, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), что значительно ограничивает потенциальную полезность этого метода. В немногих исследованиях сообщалось о внедрении этого метода в их центрах без использования масс-спектрометрии 18,19,20. Tayşi et ^al.18 сообщили о широкой категоризации GN среди Enterobacterales, Pseudomonas и Acinetobacter spp. на основе морфологии окрашивания по Граму и теста оксидазы перед интерпретацией результатов AST. В других исследованиях этого центра, проведенных Gupta et ^al.19 и Siddiqui et ^al.20, идентификация микроорганизмов на видовом уровне проводилась путем приготовления бактериальной гранулы из положительно помеченной смеси крови и бульона и ее инокуляции с помощью обычных биохимических тестов. В то время как Tayşi et ^al.18 не прокомментировали точность идентификации микроорганизмов с помощью своего подхода, Gupta et ^al.19 сообщили, что при их подходе в 165 из 176 (94%) случаев был зарегистрирован грамотрицательный грамотрицатель (RR-GN), т.е. E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и A. baumannii сложный. Однако, при последнем подходе, считывание результатов RAST проводилось ретроспективно с использованием пороговых точек диаметра зоны 8 ч только после полной инкубации обычных биохимических результатов, т.е. через 18-24 ч после инокуляции, а среднее время представления отчетности составляло около 2 дней.

Чтобы еще больше сократить TAT клинических отчетов, мы предлагаем альтернативную методологию, позволяющую раннюю идентификацию ГН, присутствующих в +aBC, с помощью aMIAST. До появления систем идентификации микроорганизмов, основанных на масс-спектрометрии, эти автоматизированные системы идентификации считались стандартом для идентификации микроорганизмов, где идентификация обеспечивалась по колориметрическим и/или флуориметрическим изменениям, вызванным тестовыми бактериями при инокулировании в миниатюрных биохимических тестах, помещенных в кассету, и сопоставлении результатов с их базой данных изолятов. Среднее время идентификации в этих системах составляет от 4 до 8 часов, однако они ограничены тем фактом, что производители рекомендуют выращивать микробы в течение ночи, прежде чем их соответствующие идентификационные карты могут быть привиты. Это требование сильно ограничивает их полезность в плане сокращения времени на отчетность.

В немногих исследованиях оценивались методы прямой идентификации микробов из +aBC с использованием этих автоматизированных систем 21,22,23,24,25,26,27. В случае +aBC, содержащих мономорфный GN, большинство исследований показало отличное соответствие между прямым посевом из бактериальных гранул, изготовленных из положительной смеси крови и бульона, и стандартной инкубацией колоний. Однако в случае грамположительных результатов показатели конкордантности были неоптимальными. Поскольку среднее время достижения положительного результата +aBC составляет от 8 до 16 часов, а идентификация GN занимает от ~4 до 8 часов в автоматизированной системе идентификации микроорганизмов, мы предполагаем, что, используя протокол прямой инокуляции в автоматизированной микробной идентификации, мы можем завершить клиническую отчетность +aBC с GN с RR-GN в течение 24 часов после получения образца.

Обстановка для исследования
Настоящее исследование проводилось в клинической бактериологической лаборатории академического института третичной медицинской помощи национального значения (INI) на 950 коек в Центральной Индии с января по октябрь 2023 года. Лаборатория оснащена системой непрерывного мониторинга культуры крови (CBCMS) и aMIAST. Бактериологическая лаборатория функционирует круглосуточно с наличием техников и микробиологов для обработки и составления отчетов о любых флаконах с положительным флаконом для посева крови (+aBCs).

Применяемые здесь микробные методы
Рабочий процесс исследования показан на рисунке 1. +aBC, показывающие мономорфные GN (+naBC), были обработаны путем прямой инокуляции соответствующих идентификационных карт для обеспечения идентификации и AST с использованием протокола EUCAST RAST. Эти результаты сравнивали со стандартным методом лечения (SoC) для +aBCs, т.е. субкультивированием на обычных плоских средах с помощью агара овечьей крови (SBA), шоколадного агара (CA) и агара Мак-Конки (MA), аэробной инкубацией в течение от 16 до 24 часов с последующей идентификацией и выдачей карт AST aMIAST при появлении изолированных колоний. Из исследования были исключены культуры крови, показывающие грамположительные кокки, грамположительные бациллы, почковающиеся дрожжевые клетки и ≥2 различных микроорганизма на исходном окрашивании по Граму или покрытых средах.

Protocol

Исследование, финансируемое за счет очного исследовательского гранта, предоставленного доктору Аюшу Гупте AIIMS Bhopal, было одобрено Институциональным комитетом по этике человека (IHEC) в письме No: IHEC-LOP/2022/IL072. ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца 5 мл был использован на основе исследован?…

Representative Results

Общие исходыВ течение периода исследования 240 +naBC были идентифицированы с помощью aMIAST с использованием как DIP, так и SIP. Из них 15% (36/240) +naBC были обнаружены полимикробными после ночной инкубации на покрытых средах. Из 204 +naBC доля RR-GN, идентифицированных с помощью SIP, составила 51,5% (10…

Discussion

С помощью DIP мы успешно идентифицировали RR-GN со значительной диагностической точностью. Среднее значение TTI после положительного определения aBC составило всего 507 мин (~ 8,5 ч). Таким образом, при использовании в сочетании с методом EUCAST RAST для определения AST, он может обеспечить идентификац?…

Materials

ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli