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Neuroscience

बेस रिकॉर्डिंग: ड्रोसोफिला में स्वाद न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/66665
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Summary

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की शायद ही कभी इस्तेमाल की जाने वाली विधि, बेस रिकॉर्डिंग, स्वाद कोडिंग की विशेषताओं के विश्लेषण की अनुमति देती है जिन्हें पारंपरिक रिकॉर्डिंग विधियों द्वारा जांच नहीं की जा सकती है। बेस रिकॉर्डिंग हाइड्रोफोबिक उत्तेजनाओं के लिए स्वाद प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की भी अनुमति देती है जिनका अध्ययन पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों का उपयोग करके नहीं किया जा सकता है।

Abstract

कीड़े स्वाद बाल, या सेंसिला के माध्यम से बाहरी दुनिया का स्वाद लेते हैं, जिनके सुझावों पर छिद्र होते हैं। जब एक सेंसिलम एक संभावित खाद्य स्रोत के संपर्क में आता है, तो खाद्य स्रोत से यौगिक छिद्र के माध्यम से प्रवेश करते हैं और भीतर न्यूरॉन्स को सक्रिय करते हैं। 50 से अधिक वर्षों के लिए, इन प्रतिक्रियाओं को टिप रिकॉर्डिंग नामक तकनीक का उपयोग करके दर्ज किया गया है। हालांकि, इस पद्धति की प्रमुख सीमाएं हैं, जिसमें उत्तेजना संपर्क से पहले या बाद में तंत्रिका गतिविधि को मापने में असमर्थता और जलीय घोल में घुलनशील होने के लिए स्वाद की आवश्यकता शामिल है। हम यहां एक तकनीक का वर्णन करते हैं जिसे हम बेस रिकॉर्डिंग कहते हैं, जो इन सीमाओं को पार करती है। बेस रिकॉर्डिंग उत्तेजना से पहले, दौरान और बाद में स्वाद न्यूरॉन गतिविधि के माप की अनुमति देता है। इस प्रकार, यह स्वाद उत्तेजना के बाद होने वाली ऑफ प्रतिक्रियाओं के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है। इसका उपयोग हाइड्रोफोबिक यौगिकों जैसे लंबी श्रृंखला वाले फेरोमोन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिनकी पानी में बहुत कम घुलनशीलता होती है। सारांश में, बेस रिकॉर्डिंग न्यूरोनल गतिविधि को मापने के साधन के रूप में एकल-सेंसिलम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के फायदे प्रदान करती है - उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प, आनुवंशिक उपकरणों की आवश्यकता के बिना - और पारंपरिक टिप रिकॉर्डिंग तकनीक की प्रमुख सीमाओं पर काबू पाती है।

Introduction

ड्रोसोफिलिड मक्खियों सहित कीड़े, एक परिष्कृत स्वाद प्रणाली से संपन्न होते हैं जो उन्हें अपने परिवेश से जटिल रासायनिक जानकारी निकालने में सक्षम बनाता है। यह प्रणाली उन्हें विभिन्न पदार्थों की रासायनिक संरचना को समझने की अनुमति देती है, जो पौष्टिक हैं और जो हानिकारकहैं 1,2 के बीच अंतर करती है।

इस प्रणाली के मूल में विशेष संरचनाएं हैं जिन्हें स्वाद बाल या सेंसिला के रूप में जाना जाता है, जो रणनीतिक रूप से शरीर के विभिन्न अंगों पर स्थित हैं। ड्रोसोफिलिड मक्खियों में, ये सेंसिला लेबलम पर स्थित होते हैं, जो मक्खी के सिर 1,2,3,4 का प्रमुख स्वाद अंग है, साथ ही पैरों और पंखों 1,2,5,6 पर भी है। लेबल सूंड की नोक पर स्थित है और दो पालियों 4,7,8 शामिल हैं. प्रत्येक पालि 31 स्वाद सेंसिला के साथ कवर किया गया है जिसे छोटे, लंबे और मध्यवर्ती 4,7,8 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। ये सेंसिला प्रत्येक घर 2-4 स्वाद न्यूरॉन्स 1,2,9,10. ये स्वाद न्यूरॉन्स कम से कम चार अलग-अलग जीन परिवारों के सदस्यों को व्यक्त करते हैं, अर्थात् गस्टेटरी रिसेप्टर (जीआर), आयनोट्रोपिक रिसेप्टर (आईआर), पिकपॉकेट (पीपीके), और क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी) जीन 1,2,11,12,13. रिसेप्टर्स और चैनलों की यह विविधता कीड़ों को रासायनिक यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला को पहचानने की क्षमता से लैस करती है, जिसमें गैर-वाष्पशील और अस्थिर संकेत 1,2,14 दोनों शामिल हैं।

50 से अधिक वर्षों के लिए, वैज्ञानिकों ने टिप रिकॉर्डिंग 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 नामक तकनीक का उपयोग करके स्वाद न्यूरॉन्स और उनके रिसेप्टर्स की प्रतिक्रिया को निर्धारित किया है ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. हालाँकि, इस पद्धति की प्रमुख सीमाएँ हैं। सबसे पहले, तंत्रिका गतिविधि को केवल उत्तेजना के संपर्क के दौरान मापा जा सकता है, और संपर्क से पहले या बाद में नहीं। यह सीमा सहज स्पाइकिंग गतिविधि के माप को रोकती है और ऑफ प्रतिक्रियाओं के माप को रोकती है। दूसरा, केवल जलीय घोल में घुलनशील स्वाद का परीक्षण किया जा सकता है।

इन सीमाओं को शायद ही कभी इस्तेमाल की जाने वाली वैकल्पिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक द्वारा दूर किया जा सकता है जिसे "बेस रिकॉर्डिंग" कहा जाता है। यहां हम इस तकनीक का वर्णन करते हैं, जिसे हमने मैरियन-पोल औरसहयोगियों 24 द्वारा उपयोग की जाने वाली विधि से अनुकूलित किया है, और महत्वपूर्ण स्वाद कोडिंग सुविधाओं को दिखाते हैं जो अब आसानी से14 को माप सकते हैं।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल येल विश्वविद्यालय के सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का अनुपालन करता है।

1. मक्खियों

  1. 12:12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र में 25 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर ताजा मानक संस्कृति शीशियों में 10-15 नई उभरी मक्खियों को रखें।
  2. 3-7 दिन पुराना होने पर मक्खियों का प्रयोग करें।

2. रसायन विज्ञान उत्तेजनाओं

  1. उच्चतम उपलब्ध शुद्धता के कीमोसेंसरी उत्तेजना प्राप्त करें। उपयोग होने तक विक्रेता द्वारा अनुशंसित अनुसार उन्हें स्टोर करें।
  2. केमोसेंसरी उत्तेजनाओं को भंग करें और पानी या किसी अन्य वांछित, गैर विषैले विलायक जैसे पैराफिन तेल में वांछित सांद्रता को पतला करें। भंग ठोस यौगिकों के मामले में 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए तैयार समाधान हिलाओ.

3. ग्लास उत्तेजना केशिका

  1. एक विंदुक खींचने वाले उपकरण का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (100 मिमी लंबाई, 1 मिमी बाहरी व्यास, 0.58 मिमी आंतरिक व्यास) से उत्तेजना को पकड़ने के लिए एक ग्लास केशिका खींचें। 3 माइक्रोन और 10 माइक्रोन के बीच एक टिप व्यास प्राप्त करने का लक्ष्य रखें।
  2. एक माइक्रोलोडर विंदुक टिप का उपयोग करके पसंदीदा उत्तेजना समाधान के साथ ग्लास केशिका भरें। बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें, जिसे कोमल दोहन द्वारा हटाया जा सकता है।
  3. यदि उत्तेजना टिप पर क्रिस्टलीकृत होती है, तो ग्लास उत्तेजना केशिका को साफ या प्रतिस्थापित करें।

4. संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड

  1. संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दोनों के लिए टंगस्टन छड़ (127 माइक्रोन व्यास और 76.2 मिमी लंबाई) का प्रयोग करें। संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को टिप पर लगभग 1 माइक्रोन व्यास तक तेज करें (इन इलेक्ट्रोड के आकार डेल्वेंथल एट अल में दर्शाए गए हैं।36) उन्हें 10% KNO3 (~ 1 M) घोल या 10% KOH (1.8 M) समाधान में कई सेकंड के लिए बार-बार डुबोकर।
    नोट: इस समाधान को इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए वर्तमान (0.3-3 एमए) की आवश्यकता होती है।

5. आधार रिकॉर्डिंग के लिए मक्खी की तैयारी

  1. शीशी से एक एस्पिरेटर में एक मक्खी ड्रा करें। एस्पिरेटर को वापस लें और अंत में उंगली रखकर जानवर को फंसाएं।
  2. मक्खी को 200 माइक्रोन प्लास्टिक विंदुक टिप में निष्कासित करें। विंदुक टिप में एस्पिरेटर के अंत को ध्यान में रखते हुए, विंदुक टिप के संकीर्ण अंत की ओर, मक्खी को आगे, हेडफर्स्ट धक्का देने के लिए अंत का उपयोग करें।
  3. एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर प्रत्येक छोर (यानी, पूर्वकाल और जानवर के पीछे) पर विंदुक टिप ट्रिम.
  4. आगे मक्खी धक्का करने के लिए या तो मिट्टी या कपास का एक छोटा सा टुकड़ा का प्रयोग करें, जब तक सिर के आधे छंटनी की विंदुक टिप के अंत से फैला हुआ है. धीरे धक्का करने के लिए संदंश का प्रयोग करें जब तक सिर के सामने लेबल उजागर नहीं होता है.
  5. मिट्टी (चित्रा 1) का उपयोग कर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर छंटनी की विंदुक टिप को ठीक करें.
  6. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, लेबलम को बाद में एक कवर पर्ची पर रखें ताकि एक लोब, इसके 31 स्वाद सेंसिला के साथ, उजागर हो(चित्रा 1)। कवर स्लिप लेबल को जगह पर रखती है।

6. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग

  1. रिग सेटअप के लिए एक कमरे का चयन करें जिसमें स्थिर तापमान और सापेक्ष आर्द्रता (<70%) हो और विद्युत और यांत्रिक शोर के स्रोतों, जैसे रेफ्रिजरेटर और सेंट्रीफ्यूज से अलग हो।
  2. माइक्रोस्कोप को एक एंटीवाइब्रेशन टेबल के केंद्र पर रखें।
  3. एंटीवाइब्रेशन टेबल (चित्रा 2) के लिए एक मैनुअल माइक्रोमैनिपुलेटर सुरक्षित करें।
  4. एक स्टेनलेस स्टील शाफ्ट संलग्न करें जो मैनुअल माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 2) के लिए टंगस्टन संदर्भ इलेक्ट्रोड रखता है।
  5. मोटर चालित जोड़तोड़ कनेक्ट करें-रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जांच के लिए एक धारक के साथ एक और एक दूसरे एक ग्लास उत्तेजना केशिका के लिए एक स्टेनलेस-स्टील शाफ्ट से जुड़े धारक के साथ एक ही टेबल का उपयोग कर खड़ा है (चित्रा 2).
  6. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जांच को एक इंटेलिजेंट डेटा एक्विजिशन कंट्रोलर (आईडीएसी) सिस्टम या किसी अन्य एम्पलीफायर/डिजिटाइज़र सिस्टम से कनेक्ट करें।
  7. इस IDAC सिस्टम को वर्कस्टेशन पर कंप्यूटर से लिंक करें।
  8. मैनुअल और मोटर चालित जोड़तोड़ को रिग के भीतर एक ही स्थान पर ग्राउंड करें।
  9. कंप्यूटर पर IDAC सिस्टम के लिए उपयुक्त अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि डिजिटल अधिग्रहण ड्राइवर कंप्यूटर पर ऑपरेटिंग सिस्टम (जैसे, विंडोज एक्सपी -7, -8, या -10) के साथ संगत हैं।

7. स्वाद सेंसिला से रिकॉर्डिंग

  1. स्थिति में एक कम बढ़ाई (जैसे, 10x) उद्देश्य के साथ खुर्दबीन चरण पर तैयारी स्लाइड रखें. चरण को तब तक ले जाएं जब तक कि लेबलम कम-आवर्धन और उच्च-आवर्धन (जैसे, 50x) दोनों उद्देश्यों पर देखने के क्षेत्र के केंद्र में ध्यान केंद्रित न करे।
  2. कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करके आंख में संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें। संदर्भ इलेक्ट्रोड सम्मिलित करने के लिए, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ पक्ष विपरीत मक्खी के पक्ष में आंख को लक्षित करें, उदाहरण के लिए, यदि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दाईं ओर से आ रहा है, तो संदर्भ इलेक्ट्रोड को बाईं आंख में रखें। सटीक सम्मिलन के लिए एक मैनुअल माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें।
  3. मोटर चालित माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 3) का उपयोग करके कम आवर्धन और उच्च आवर्धन दोनों उद्देश्यों के देखने के क्षेत्र के केंद्र में ग्लास उत्तेजना केशिका की नोक को ध्यान में लाएं।
  4. कम आवर्धन के तहत, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को दूसरे मोटर चालित माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके लेबलम के करीब लाएं।
  5. उच्च आवर्धन के तहत, मोटर चालित माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके एक स्वाद सेंसिलम के आधार में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालें जब तक कि आईडीएसी सिस्टम के ऑडियो आउटपुट से न्यूरोनल फायरिंग गतिविधि की आवाज सुनाई न दे।
  6. एक बार एक स्थिर संकेत स्थापित हो जाने के बाद, आईडीएसी प्रणाली (चित्रा 4ए-डी) के साथ आने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सिग्नल रिकॉर्ड करना शुरू करें। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, दबाएं रिकॉर्डिंग शुरू बटन।
  7. मोटर चालित मैनिपुलेटर का उपयोग करके स्वाद सेंसिलम की नोक को कवर करने के लिए उत्तेजना ग्लास केशिका की नोक लाओ।
  8. उत्तेजना को समाप्त करने के लिए, मोटर चालित मैनिपुलेटर का उपयोग करके सेंसिलम से ग्लास उत्तेजना केशिका को हटा दें।
  9. मैन्युअल एक पेडल का उपयोग कर उत्तेजना की शुरुआत और अंत चिह्नित करें. पेडल आईडीएसी से जुड़ा है, और सॉफ्टवेयर के साथ इसके संचार को उत्तेजना की शुरुआत/अंत को चिह्नित करने के लिए आईडीएसी के माध्यम से सुविधा प्रदान की जाती है।

8. विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर के विभिन्न कार्यों का उपयोग करें जो आईडीएसी प्रणाली के साथ आयाम (जब संभव हो) द्वारा स्पाइक आबादी को सॉर्ट करने और प्रतिक्रिया गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए आता है।
    1. स्पाइक्स गिनने के लिए, ब्याज की रिकॉर्डिंग पर बायाँ-क्लिक करें, चुनने के लिए एक विंडो लाएँ। स्पाइक्स चुनें, एक और विंडो शुरू करें जिसका नाम है तरंगों को स्पाइक्स में बदलें। नए फ़ील्ड में एक नाम दर्ज करें और ओके बटन दबाएं।
    2. चरण 8.1.1 में नई फ़ील्ड में नाम दर्ज करना आयाम हिस्टोग्राम दृश्य की ओर जाता है। गणना करने के लिए आयाम चुनें, फिर इस दृश्य को बंद करें। काउंटर जोड़ने के लिए बायाँ-क्लिक करें.
    3. सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण के आधार पर निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए मैन्युअल रूप से स्पाइक्स की जांच करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर भी आगे विश्लेषण के लिए विभिन्न स्वरूपों में डेटा के निर्यात की अनुमति देता है.

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Representative Results

चित्रा 4 ए सहज स्पाइक्स दिखाता है जो एक सेंसिलम से उत्पन्न होता है। वे आयाम के आधार पर दो वर्गों में आते हैं, न्यूरॉन से प्राप्त होने वाले बड़े स्पाइक्स के साथ जो कड़वे यौगिकों के प्रति संवेदनशील होते हैं और न्यूरॉन से छोटे स्पाइक्स जो शर्करा का जवाब देते हैं। स्पाइक आयाम और कार्यात्मक विशिष्टता के बीच संबंध आनुवंशिक प्रयोगों 4,14,37,38,39 द्वारा पुष्टि की गई है।

चित्रा 4 बी डीईईटी की गंध के लिए एस 5 सेंसिलम के कड़वा-संवेदनशील न्यूरॉन की प्रतिक्रिया दिखाता है; यह प्रतिक्रिया डीईईटी समाधान और सेंसिलम के बीच किसी भी संपर्क के बिना हुई। एक स्पाइक मध्यवर्ती आयाम का प्रतीत होता है और दो छोटे स्पाइक्स के सुपरपोजिशन के परिणामस्वरूप हो सकता है, एक चीनी न्यूरॉन से और एक मैकेनोसेंसरी न्यूरॉन से।

चित्रा 4 सी पर प्रतिक्रिया है कि एक कड़वा उत्तेजना और I1 sensillum के बीच संपर्क के बाद होता है से पता चलता है, एक बंद प्रतिक्रिया है कि संपर्क की समाप्ति के बाद होता है द्वारा पीछा किया. ऐसा नहीं है कि ऑफ प्रतिक्रिया का परिमाण, स्पाइक्स/एस में मापा जाता है, ऑन प्रतिक्रिया से अधिक है।

चित्रा 4 डी मक्खी की एक अन्य प्रजाति, ड्रोसोफिला virilis के एक I1 सेंसिलम से कड़वा यौगिक berberine के लिए एक पर और एक बंद प्रतिक्रिया से पता चलता है. इस तकनीक के फायदों में से एक यह है कि यह मच्छरों सहित अन्य प्रजातियों पर किया जा सकता है, बिना किसी ट्रांसजीन को पेश करने की आवश्यकता के।

चित्रा 4E रिकॉर्डिंग के दौरान हो सकती हैं जो दो समस्याओं को दिखाता है। सबसे पहले, यदि लेबलम ठीक से सुरक्षित नहीं है तो यह स्थानांतरित हो सकता है, सेंसिलम के मैकेनोसेंसरी न्यूरॉन से स्पाइक्स का उत्पादन कर सकता है। दूसरा, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सेंसिलम से उखाड़ फेंका जा सकता है, अक्सर लेबलम के आंदोलन के परिणामस्वरूप। इस मामले में, संपर्क खो जाता है और इलेक्ट्रोड को स्पाइक्स रिकॉर्ड करने के लिए फिर से डाला जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: बेस रिकॉर्डिंग के लिए फ्लाई तैयारी। एक छंटनी विंदुक टिप जिसमें एक मादा मक्खी होती है जिसमें लेबलम सुरक्षित रूप से एक ग्लास कवरस्लिप पर रखा जाता है। (ए) विंदुक टिप और coverslip दोनों मिट्टी के टीले पर सुरक्षित रूप से आयोजित कर रहे हैं. (बी) एक कवरस्लिप पर आराम करने वाले लेबलम का उच्च आवर्धन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग सेटअप। (ए) संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए एक मैनुअल माइक्रोमैनिपुलेटर, ग्लास उत्तेजना केशिका के लिए एक मोटर चालित माइक्रोमैनिपुलेटर, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए एक मोटर चालित माइक्रोमैनिपुलेटर की स्थिति दिखाने वाला एक सिंहावलोकन। (बी) संदर्भ इलेक्ट्रोड, ग्लास उत्तेजना केशिका, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए धारकों दिखा अवलोकन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लेबलम और सेंसिला। (ए) एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत लेबलम। लेबलम के एक लोब के स्वाद सेंसिला को दिखाते हुए लेबलम का क्लोज-अप। यह उत्तेजना ग्लास केशिका को एल 2 (बड़े प्रकार 2) के रूप में जाना जाने वाला बड़े सेंसिला में से एक के करीब और इस सेंसिलम के आधार में एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दिखाता है। (बी) लेबलर सेंसिला की पहुंच। लेबलम सेंसिला दिखा रहा है जो बेस रिकॉर्डिंग और सेंसिला के लिए आसानी से सुलभ है जो तैयारी में उनकी स्थिति के कारण कम सुलभ हैं जो हम आम तौर पर उपयोग करते हैं। संक्षिप्ताक्षर: ए = पूर्वकाल; एम = औसत दर्जे का; P = पश्च; एल = पार्श्व। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सहज spikes, कड़वा न्यूरॉन प्रतिक्रियाओं, और suboptimal रिकॉर्डिंग के उदाहरण निशान. (ए) सहज spikes के उदाहरण निशान. स्पाइक्स एक कड़वा-संवेदनशील न्यूरॉन (लाल डॉट्स) और एक I1 सेंसिलम में एक चीनी-संवेदनशील न्यूरॉन (हरे डॉट्स) से होते हैं। सेंसिलम के ड्राइंग में, कड़वा, चीनी और मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स क्रमशः लाल, हरे और काले रंग के होते हैं। (बी) 1 एमएम डीईईटी के वाष्प के लिए एस 5 सेंसिलम में कड़वा न्यूरॉन (लाल डॉट्स) की प्रतिक्रिया का उदाहरण ट्रेस। ध्यान दें कि छोटे आयाम स्पाइक्स चीनी न्यूरॉन और मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स से हैं, जो इस उदाहरण में ट्रेस आयाम द्वारा भेद करना मुश्किल है। संक्षिप्तीकरण: डीईईटी = एन, एन-डायथाइल-मेटा-टोल्यूमाइड। (सी) I1 सेंसिला में एक कड़वा न्यूरॉन से 1 एमएम डेनाटोनियम बेंजोएट तक ऑन और ऑफ प्रतिक्रियाओं का उदाहरण ट्रेस। स्पाइक्स उत्तेजना के साथ संपर्क से पहले (सहज फायरिंग), (ऑन प्रतिक्रिया), और बाद में (ऑफ प्रतिक्रिया) देखे जाते हैं। संक्षिप्तीकरण: DEN = denatonium benzoate। (डी)डी virilis के I1 सेंसिला में एक कड़वा न्यूरॉन से 0.5 मिमी berberine क्लोराइड के लिए पर और बंद प्रतिक्रियाओं का उदाहरण ट्रेस. संपर्क के पहले, दौरान और बाद में स्पाइक्स देखे जाते हैं। संक्षिप्तीकरण: BER = berberine क्लोराइड। (ई) एक suboptimal रिकॉर्डिंग के उदाहरण ट्रेस. लेबलम के आंदोलन के कारण प्रयोग के बीच में संपर्क खो गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कुछ प्रकार के सेंसिला से रिकॉर्डिंग में, विभिन्न न्यूरॉन्स के स्पाइक्स को अलग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, एस और आई सेंसिला के चीनी न्यूरॉन्स और मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स समान आयामों के स्पाइक्स का उत्पादन करते हैं, जिससे उन्हें 4,14 भेद करना मुश्किल हो जाता है। हम पाते हैं कि एक बहुत तेज टंगस्टन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन की फायरिंग को कम करता है, जैसा कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का विवेकपूर्ण प्लेसमेंट करता है। सेंसिलम सॉकेट के कॉलर में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का सम्मिलन (यानी आधार में लेकिन गहरा नहीं) अक्सर कम मैकेनोसेंसरी उत्तेजना में परिणाम देता है। इसके अतिरिक्त, हम पाते हैं कि अगर एक रिकॉर्डिंग में मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन की उच्च स्तर की फायरिंग होती है, तो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को वापस लेना और सेंसिलम के सापेक्ष इसे एक अलग स्थिति में रखना अक्सर फायरिंग के निचले स्तर की ओर जाता है।

प्रयोगों के दौरान रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिरता सुनिश्चित करना एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है ( चित्रा 4ई देखें)। इलेक्ट्रोड स्थिति में यांत्रिक गड़बड़ी या बदलाव रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकते हैं। पूरी तरह से तैयारी में समय और प्रयास का निवेश, जैसा कि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट है, निराशा को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है जो लेबलम आंदोलन के परिणामस्वरूप हो सकता है।

हम एक अन्य मुद्दे पर ध्यान देते हैं जिसे हमने कुछ यौगिकों के साथ देखा है जो I-a कक्षा14 के I सेंसिला से ON और OFF दोनों प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करते हैं। कभी-कभी, एक उत्तेजना की दूसरी डिलीवरी बंद हो जाती है लेकिन चालू प्रतिक्रिया नहीं। ऑन प्रतिक्रिया में इस कमी का कारण अज्ञात है।

बेस रिकॉर्डिंग में एक और चुनौती यह है कि सभी सेंसिला लेबलम पर अपनी स्थिति के कारण रिकॉर्डिंग के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। 31 लेबलर सेंसिला में से, केवल 26 से रिकॉर्ड करने के लिए सुविधाजनक हैं, तकनीक के लिए एक सीमा पेश करते हैं, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। हालांकि, सिद्धांत रूप में, इन सेंसिला (I8, I9, I10, L9, और S10) को ओलिंप माइक्रोस्कोप मैकेनिकल XY चरण के रोटेशन द्वारा सुलभ बनाया जा सकता है।

अंत में, हम मक्खी की तैयारी में निवेश के प्रयास के महत्व पर जोर देते हैं। एक अच्छी तरह से तैयार मक्खी बहुत अधिक प्रयोग के पाठ्यक्रम के दौरान विश्वसनीय और उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग उपज की संभावना है. इसके अतिरिक्त, रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए सुक्रोज का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है; यह सभी लेबलर सेंसिला से प्रतिक्रिया प्राप्त करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम समर्थन के लिए ज़िना बर्मन, पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए लिसा बेक और चर्चा के लिए कार्लसन प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान K01 DC020145 एचकेएमडी का समर्थन किया गया था; और NIH R01 DC02174, R01 DC04729, और R01 DC011697 को J.R.C को अनुदान देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX51WI equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration Table TMC 63-7590E
motorized Micromanipulators Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators Märzhäuser Micromanipulators MM33 Micromanipulator
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers Ockenfels Syntech GmbH Stimulus Controller CS 55
Personal Computer Dell Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod A-M Systems Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope Olympus VMZ 1x-4x For fly preparation
p200 Pipette Tips Generic
Microloader tips  Eppendorf E5242956003
1 ml Syringe Generic
Crocodile clips
Power Transformers STACO ENERGY PRODUCTS STACO 3PN221B Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Generic
Plastic Tubing Saint Gobain Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials Archon Scientific Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER) Sigma-Aldrich Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN) Sigma-Aldrich Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) Sigma-Aldrich Cat# 36542

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (205), e66665, doi:10.3791/66665 (2024).

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