Light-sheet billeddannelse for at afsløre hjertestruktur i gnaverhjerter
Summary
Protokollen anvender avanceret lysarkmikroskopi sammen med tilpassede vævsrensningsmetoder til at undersøge indviklede hjertestrukturer i gnaverhjerter, hvilket har stort potentiale for forståelse af hjertemorfogenese og ombygning.
Abstract
Light-sheet mikroskopi (LSM) spiller en afgørende rolle i forståelsen af hjertets indviklede tredimensionelle (3D) struktur og giver afgørende indsigt i grundlæggende hjertefysiologi og patologiske reaktioner. Vi dykker hermed ned i udviklingen og implementeringen af LSM-teknikken til at belyse hjertets mikroarkitektur i musemodeller. Metoden integrerer et tilpasset LSM-system med vævsrensningsteknikker, der mindsker lysspredning i hjertevæv til volumetrisk billeddannelse. Kombinationen af konventionel LSM med billedsømning og multiview dekonvolutionsmetoder giver mulighed for indfangning af hele hjertet. For at imødegå den iboende afvejning mellem aksial opløsning og synsfelt (FOV) introducerer vi yderligere en aksialt fejet lysarkmikroskopi (ASLM) metode for at minimere ude af fokus lys og ensartet belyse hjertet på tværs af udbredelsesretningen. I mellemtiden forbedrer vævsrensningsmetoder som iDISCO lysindtrængning, letter visualiseringen af dybe strukturer og sikrer en omfattende undersøgelse af myokardiet gennem hele hjertet. Kombinationen af de foreslåede LSM- og vævsrensningsmetoder udgør en lovende platform for forskere i at løse hjertestrukturer i gnaverhjerter, hvilket har et stort potentiale for forståelsen af hjertemorfogenese og ombygning.
Introduction
Hjertesvigt er fortsat den største årsag til dødelighed på verdensplan, primært på grund af manglen på regenerativ kapacitet af modne kardiomyocytter1. Hjertets indviklede arkitektur spiller en afgørende rolle i dets funktion og giver indsigt i udviklingsprocesser. En dyb forståelse af hjertestruktur er afgørende for at belyse de grundlæggende processer i hjertemorfogenese og ombygning som reaktion på myokardieinfarkt. Nylige fremskridt har vist, at neonatale mus kan genoprette hjertefunktionen efter skade, mens voksne mus mangler en sådan regenerativ kapacitet2. Dette skaber et grundlag for at undersøge signaler forbundet med strukturelle og funktionelle abnormiteter i musemodeller. Traditionelle billeddannelsesmetoder, såsom konfokal mikroskopi, har tekniske begrænsninger, herunder begrænset penetrationsdybde, langsomt punktscanningsskema og fotoskader fra langvarig eksponering for laserlys. Disse hindrer omfattende tredimensionel (3D) billeddannelse af det intakte hjerte. I denne sammenhæng fremstår lysarkmikroskopi (LSM) som en kraftfuld løsning, der tilbyder fordelene ved højhastighedsbilleddannelse, reduceret fotoskade og enestående optiske sektionsfunktioner 3,4,5. De unikke egenskaber ved LSM placerer det som en lovende metode til at overvinde begrænsningerne ved konventionelle teknikker, hvilket giver hidtil uset indsigt i hjerteudviklings– og ombygningsprocesser 6,7,8.
I denne protokol introducerer vi en billeddannelsesstrategi, der kombinerer avanceret LSM med tilpassede vævsrensningsmetoder9, hvilket giver mulighed for billeddannelse af hele musehjerter uden behov for specifik mærkning og mekanisk sektionering. Vi foreslår endvidere, at konventionel LSM-billeddannelse kan forbedres gennem multiview deconvolution10 eller aksialt fejet lysarkmikroskopi (ASLM) teknikker 11,12,13,14,15 for at forbedre aksial opløsning. Derudover kan integrationen af billedsyning med en af disse metoder effektivt overvinde afvejningen mellem rumlig opløsning og synsfelt (FOV) og derved fremme billeddannelsen af voksne musehjerter. Inkorporeringen af adskillige vævsrensningsmetoder, herunder hydrofobe, hydrofile og hydrogelbaserede metoder, muliggør dybere lysindtrængning til at fange morfologien i hele hjertet 16,17,18,19.
Mens flere clearingmetoder er kompatible med nuværende LSM-systemer, er målet at minimere fotonspredning og forbedre lysindtrængning i væv, som hjertet, ved at erstatte lipider med et medium, der nøje matcher dets brydningsindeks. iDISCO blev valgt som repræsentant20,21 og tilpasset til autofluorescensbilleddannelse i denne protokol på grund af dens hurtige behandling og høje gennemsigtighed (figur 1A). Samlet set giver integrationen af den avancerede LSM-tilgang med vævsrensningsteknikker en lovende ramme for at optrævle indviklet hjerteanatomi i gnaverhjerter, hvilket har et betydeligt potentiale for at fremme vores forståelse af hjertemorfogenese og patogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af billeddannelse, beregning og vævsrensningsmetoder har givet en enestående mulighed for i vid udstrækning at undersøge hjertestruktur og funktion. Dette rummer et stort potentiale for at uddybe vores forståelse af hjertemorfogenese og patogenese ved hjælp af en intakt gnaverhjertemodel. I modsætning til in vivo-studier af zebrafiskens hjerte ved hjælp af en lignende tilgang 40,41,42,43 gør integrationen af avancerede LSM-teknikker og vævsrensningsmetoder det muligt for os at overvinde udf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Dr. Eric Olsons gruppe på UT Southwestern Medical Center for generøst at dele dyremodellerne. Vi sætter pris på alle de konstruktive kommentarer fra D-inkubatormedlemmer på UT Dallas. Dette arbejde blev støttet af NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) og UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
