Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores
Summary
O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
Abstract
A microscopia de folha de luz (LSM) desempenha um papel fundamental na compreensão da intrincada estrutura tridimensional (3D) do coração, fornecendo informações cruciais sobre a fisiologia cardíaca fundamental e as respostas patológicas. Por meio deste, investigamos o desenvolvimento e a implementação da técnica LSM para elucidar a microarquitetura do coração em modelos de camundongos. A metodologia integra um sistema LSM personalizado com técnicas de limpeza de tecidos, mitigando a dispersão de luz dentro dos tecidos cardíacos para imagens volumétricas. A combinação de LSM convencional com costura de imagem e abordagens de deconvolução multiview permite a captura de todo o coração. Para abordar o trade-off inerente entre resolução axial e campo de visão (FOV), introduzimos ainda um método de microscopia de folha de luz varrida axialmente (ASLM) para minimizar a luz fora de foco e iluminar uniformemente o coração em toda a direção de propagação. Enquanto isso, os métodos de limpeza de tecidos, como o iDISCO, aumentam a penetração da luz, facilitando a visualização de estruturas profundas e garantindo um exame abrangente do miocárdio em todo o coração. A combinação dos métodos propostos de LSM e limpeza de tecidos apresenta uma plataforma promissora para pesquisadores na resolução de estruturas cardíacas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
Introduction
A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de mortalidade em todo o mundo, principalmente devido à falta de capacidade regenerativa dos cardiomiócitos maduros1. A intrincada arquitetura do coração desempenha um papel crucial em sua função e fornece informações sobre os processos de desenvolvimento. Uma compreensão profunda da estrutura cardíaca é essencial para elucidar os processos fundamentais da morfogênese e remodelamento cardíaco em resposta ao infarto do miocárdio. Progressos recentes demonstraram que camundongos recém-nascidos podem restaurar a função cardíaca após lesão, enquanto camundongos adultos não têm essa capacidade regenerativa2. Isso estabelece uma base para investigar pistas associadas a anormalidades estruturais e funcionais em modelos de camundongos. Os métodos tradicionais de imagem, como a microscopia confocal, têm limitações técnicas, incluindo profundidade de penetração restrita, esquema de varredura de ponto lento e danos fotográficos causados pela exposição prolongada à luz laser. Isso dificulta a aquisição de imagens tridimensionais (3D) abrangentes do coração intacto. Nesse contexto, a microscopia de folha de luz (LSM) surge como uma solução poderosa, oferecendo as vantagens da imagem de alta velocidade, danos fotográficos reduzidos e recursos excepcionais de seccionamento óptico 3,4,5. As características únicas do LSM o posicionam como um método promissor para superar as limitações das técnicas convencionais, fornecendo insights sem precedentes sobre os processos de desenvolvimento e remodelação cardíaca 6,7,8.
Neste protocolo, introduzimos uma estratégia de imagem que combina LSM avançado com abordagens adaptadas de limpeza de tecidos9, permitindo a imagem de corações inteiros de camundongos sem a necessidade de marcação específica e seccionamento mecânico. Propomos ainda que a imagem LSM convencional pode ser aprimorada por meio de técnicas de deconvolução multiview10 ou microscopia de folha de luz varrida axialmente (ASLM) 11,12,13,14,15 para melhorar a resolução axial. Além disso, a integração da costura de imagens com qualquer um desses métodos pode efetivamente superar o trade-off entre resolução espacial e campo de visão (FOV), avançando assim a imagem de corações de camundongos adultos. A incorporação de inúmeras abordagens de limpeza de tecidos, incluindo métodos hidrofóbicos, hidrofílicos e baseados em hidrogel, permite uma penetração de luz mais profunda para capturar a morfologia de todo o coração 16,17,18,19.
Embora vários métodos de limpeza sejam compatíveis com os sistemas LSM atuais, o objetivo é minimizar a dispersão de fótons e aumentar a penetração da luz nos tecidos, como o coração, substituindo os lipídios por um meio que corresponda ao seu índice de refração. O iDISCO foi escolhido como o representante 20,21 e adaptado para imagens de autofluorescência neste protocolo devido ao seu rápido processamento e alta transparência (Figura 1A). Coletivamente, a integração da abordagem avançada do LSM com técnicas de limpeza de tecidos oferece uma estrutura promissora para desvendar a intrincada anatomia cardíaca em corações de roedores, com potencial significativo para avançar nossa compreensão da morfogênese e patogênese cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
O avanço dos métodos de imagem, computação e limpeza de tecidos proporcionou uma oportunidade incomparável para investigar extensivamente a estrutura e a função cardíaca. Isso tem um grande potencial para aprofundar nossa compreensão da morfogênese e patogênese cardíaca usando um modelo de coração de roedor intacto. Em contraste com estudos in vivo de coração de peixe-zebra usando uma abordagem semelhante 40,41,42,43, a integração de técnicas avançadas de LSM e métodos de limpeza de tecidos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expressamos nossa gratidão ao grupo do Dr. Eric Olson no UT Southwestern Medical Center por compartilhar generosamente os modelos animais. Agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS program (YD).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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