Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori
Summary
Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.
Abstract
La microscopia a foglio luminoso (LSM) svolge un ruolo fondamentale nella comprensione dell’intricata struttura tridimensionale (3D) del cuore, fornendo informazioni cruciali sulla fisiologia cardiaca fondamentale e sulle risposte patologiche. Approfondiamo lo sviluppo e l’implementazione della tecnica LSM per chiarire la microarchitettura del cuore nei modelli murini. La metodologia integra un sistema LSM personalizzato con tecniche di pulizia dei tessuti, mitigando la dispersione della luce all’interno dei tessuti cardiaci per l’imaging volumetrico. La combinazione di LSM convenzionale con approcci di cucitura delle immagini e deconvoluzione multiview consente l’acquisizione dell’intero cuore. Per affrontare il compromesso intrinseco tra risoluzione assiale e campo visivo (FOV), introduciamo inoltre un metodo di microscopia a foglio luminoso a scansione assiale (ASLM) per ridurre al minimo la luce sfocata e illuminare uniformemente il cuore attraverso la direzione di propagazione. Nel frattempo, i metodi di pulizia dei tessuti come iDISCO migliorano la penetrazione della luce, facilitando la visualizzazione delle strutture profonde e garantendo un esame completo del miocardio in tutto il cuore. La combinazione dei metodi LSM e di pulizia dei tessuti proposti presenta una piattaforma promettente per i ricercatori nella risoluzione delle strutture cardiache nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.
Introduction
L’insufficienza cardiaca rimane la principale causa di mortalità in tutto il mondo, principalmente a causa della mancanza di capacità rigenerativa dei cardiomiociti maturi1. L’intricata architettura del cuore svolge un ruolo cruciale nella sua funzione e fornisce informazioni sui processi di sviluppo. Una profonda comprensione della struttura cardiaca è essenziale per chiarire i processi fondamentali della morfogenesi cardiaca e del rimodellamento in risposta all’infarto del miocardio. Recenti progressi hanno dimostrato che i topi neonatali possono ripristinare la funzione cardiaca dopo una lesione, mentre i topi adulti mancano di tale capacità rigenerativa2. Ciò stabilisce una base per lo studio dei segnali associati ad anomalie strutturali e funzionali nei modelli murini. I metodi di imaging tradizionali, come la microscopia confocale, presentano limitazioni tecniche, tra cui una profondità di penetrazione limitata, uno schema di scansione a punti lento e danni fotografici dovuti all’esposizione prolungata alla luce laser. Questi ostacolano l’imaging tridimensionale completo (3D) del cuore intatto. In questo contesto, la microscopia a foglio luminoso (LSM) emerge come una soluzione potente, che offre i vantaggi dell’imaging ad alta velocità, la riduzione dei danni fotografici e le eccezionali capacità di sezionamento ottico 3,4,5. Le caratteristiche uniche dell’LSM lo posizionano come un metodo promettente per superare i limiti delle tecniche convenzionali, fornendo informazioni senza precedenti sullo sviluppo cardiaco e sui processi di rimodellamento 6,7,8.
In questo protocollo, introduciamo una strategia di imaging che combina LSM avanzato con approcci di pulizia tissutale adattati9, consentendo l’imaging di interi cuori di topo senza la necessità di una marcatura specifica e di un sezionamento meccanico. Proponiamo inoltre che l’imaging LSM convenzionale possa essere migliorato attraverso la deconvoluzione multiview10 o le tecniche di microscopia a foglio di luce a scansione assiale (ASLM) 11,12,13,14,15 per migliorare la risoluzione assiale. Inoltre, l’integrazione dell’unione delle immagini con uno di questi metodi può superare efficacemente il compromesso tra risoluzione spaziale e campo visivo (FOV), facendo così progredire l’imaging dei cuori di topo adulto. L’incorporazione di numerosi approcci di pulizia dei tessuti, inclusi metodi idrofobici, idrofili e basati su idrogel, consente una penetrazione della luce più profonda per catturare la morfologia dell’intero cuore 16,17,18,19.
Sebbene i metodi di purificazione multipli siano compatibili con gli attuali sistemi LSM, l’obiettivo è ridurre al minimo la dispersione dei fotoni e migliorare la penetrazione della luce nei tessuti, come il cuore, sostituendo i lipidi con un mezzo che corrisponda strettamente al suo indice di rifrazione. iDISCO è stato scelto come rappresentante20,21 e adattato per l’imaging in autofluorescenza in questo protocollo grazie alla sua rapida elaborazione e all’elevata trasparenza (Figura 1A). Nel complesso, l’integrazione dell’approccio LSM avanzato con le tecniche di pulizia dei tessuti offre un quadro promettente per svelare l’intricata anatomia cardiaca nei cuori dei roditori, con un potenziale significativo per far progredire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il progresso dei metodi di imaging, calcolo e pulizia dei tessuti ha fornito un’opportunità senza precedenti per studiare ampiamente la struttura e la funzione cardiaca. Ciò ha un grande potenziale per approfondire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca utilizzando un modello di cuore di roditore intatto. A differenza degli studi in vivo sul cuore del pesce zebra che utilizzano un approccio simile 40,41,42,43, l’integrazione di tecniche LSM avanzate e metodi di pulizia dei tessuti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimiamo la nostra gratitudine al gruppo del Dr. Eric Olson presso l’UT Southwestern Medical Center per aver generosamente condiviso i modelli animali. Apprezziamo tutti i commenti costruttivi forniti dai membri dell’incubatore D presso UT Dallas. Questo lavoro è stato supportato dal programma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS (YD).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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