Light-Sheet Imaging för att avslöja hjärtstruktur i gnagarhjärtan
Summary
Protokollet använder avancerad light-sheet-mikroskopi tillsammans med anpassade vävnadsrensningsmetoder för att undersöka intrikata hjärtstrukturer i gnagarhjärtan, vilket har stor potential för förståelsen av hjärtats morfogenes och remodellering.
Abstract
Light-sheet-mikroskopi (LSM) spelar en central roll för att förstå den intrikata tredimensionella (3D) strukturen i hjärtat, vilket ger viktiga insikter om grundläggande hjärtfysiologi och patologiska svar. Vi fördjupar oss härmed i utvecklingen och implementeringen av LSM-tekniken för att belysa hjärtats mikroarkitektur i musmodeller. Metodiken integrerar ett skräddarsytt LSM-system med vävnadsrensningstekniker, vilket minskar ljusspridning i hjärtvävnad för volymetrisk avbildning. Kombinationen av konventionell LSM med bildsammanfogning och multiview-dekonvolutionsmetoder gör det möjligt att fånga hela hjärtat. För att ta itu med den inneboende kompromissen mellan axiell upplösning och synfält (FOV) introducerar vi dessutom en axiellt svept light-sheet-mikroskopimetod (ASLM) för att minimera oskarpt ljus och jämnt belysa hjärtat över utbredningsriktningen. Under tiden förbättrar vävnadsrensningsmetoder som iDISCO ljusgenomträngningen, vilket underlättar visualiseringen av djupa strukturer och säkerställer en omfattande undersökning av myokardium i hela hjärtat. Kombinationen av de föreslagna LSM- och vävnadsrensningsmetoderna utgör en lovande plattform för forskare när det gäller att lösa upp hjärtstrukturer i gnagarhjärtan, vilket har stor potential för förståelsen av hjärtats morfogenes och remodellering.
Introduction
Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, främst på grund av bristen på regenerativ kapacitet hos mogna kardiomyocyter1. Hjärtats intrikata arkitektur spelar en avgörande roll för dess funktion och ger insikter i utvecklingsprocesser. En djup förståelse av hjärtats struktur är avgörande för att belysa de grundläggande processerna för hjärtats morfogenes och remodellering som svar på hjärtinfarkt. Nya framsteg har visat att neonatala möss kan återställa hjärtfunktionen efter skada, medan vuxna möss saknar sådan regenerativ kapacitet2. Detta skapar en grund för att undersöka signaler associerade med strukturella och funktionella abnormiteter i musmodeller. Traditionella avbildningsmetoder, såsom konfokalmikroskopi, har tekniska begränsningar, inklusive begränsat penetrationsdjup, långsamt punktskanningsschema och fotoskador från långvarig exponering för laserljus. Dessa hindrar en omfattande tredimensionell (3D) avbildning av det intakta hjärtat. I detta sammanhang framstår light-sheet-mikroskopi (LSM) som en kraftfull lösning, som erbjuder fördelarna med höghastighetsavbildning, minskade fotoskador och exceptionella optiska snittningsmöjligheter 3,4,5. De unika egenskaperna hos LSM positionerar den som en lovande metod för att övervinna begränsningarna hos konventionella tekniker, vilket ger oöverträffade insikter i hjärtutveckling och ombyggnadsprocesser 6,7,8.
I det här protokollet introducerar vi en avbildningsstrategi som kombinerar avancerad LSM med anpassade vävnadsrensningsmetoder9, vilket möjliggör avbildning av hela mushjärtan utan behov av specifik märkning och mekanisk snittning. Vi föreslår vidare att konventionell LSM-avbildning kan förbättras genom multiview deconvolution10 eller axiellt svept light-sheet mikroskopi (ASLM) tekniker 11,12,13,14,15 för att förbättra axiell upplösning. Dessutom kan integreringen av bildsammanfogning med någon av dessa metoder effektivt övervinna kompromissen mellan rumslig upplösning och synfält (FOV), och därigenom främja avbildningen av vuxna mushjärtan. Inkorporeringen av många vävnadsrensningsmetoder, inklusive hydrofoba, hydrofila och hydrogelbaserade metoder, möjliggör djupare ljuspenetration för att fånga morfologin i hela hjärtat 16,17,18,19.
Även om flera clearingmetoder är kompatibla med nuvarande LSM-system, är målet att minimera fotonspridning och förbättra ljuspenetrationen i vävnader, som hjärtat, genom att ersätta lipider med ett medium som nära matchar dess brytningsindex. iDISCO valdes som representant20,21 och anpassades för autofluorescensavbildning i detta protokoll på grund av dess snabba bearbetning och höga transparens (Figur 1A). Sammantaget erbjuder integrationen av den avancerade LSM-metoden med vävnadsrensningstekniker ett lovande ramverk för att reda ut intrikata hjärtanatomier i gnagarhjärtan, vilket har en betydande potential för att främja vår förståelse av hjärtats morfogenes och patogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framstegen inom avbildning, beräkning och vävnadsrensningsmetoder har gett en oöverträffad möjlighet att i stor utsträckning undersöka hjärtats struktur och funktion. Detta har stor potential för att fördjupa vår förståelse av hjärtats morfogenes och patogenes med hjälp av en intakt hjärtmodell från gnagare. Till skillnad från in vivo-studier av zebrafiskhjärta med ett liknande tillvägagångssätt 40,41,42,43, gör integrationen av avancerade LSM-tekniker och vävnadsrensningsmetoder det möj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrycker vår tacksamhet till Dr. Eric Olsons grupp vid UT Southwestern Medical Center för att generöst dela med sig av djurmodellerna. Vi uppskattar alla konstruktiva kommentarer från D-inkubatorns medlemmar på UT Dallas. Detta arbete stöddes av NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) och UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
- Sands, G. B., et al. It’s clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol – Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).
