שיטות להפעלת תעתיק מרחבי של רקמות עצם

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת decalcification של רקמות עצם שהושגו טרי ושימור של RNA באיכות גבוהה. שיטה מודגמת גם לחיתוך דגימות פורמלין קבוע פרפין משובץ (FFPE) של עצמות לא demineralized כדי להשיג תוצאות באיכות טובה אם רקמות טריות אינן זמינות או לא ניתן לאסוף.

Abstract

הבנת הקשר בין התאים ומיקומם בתוך כל רקמה היא קריטית כדי לחשוף את התהליכים הביולוגיים הקשורים להתפתחות תקינה ולפתולוגיה של מחלות. שעתוק מרחבי היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת ניתוח של כל התעתיק בתוך דגימות רקמה, ובכך מספקת מידע על ביטוי הגן התאי ועל ההקשר ההיסטולוגי שבו שוכנים התאים. בעוד שיטה זו כבר בשימוש נרחב עבור רקמות רכות רבות, היישום שלה עבור ניתוח של רקמות קשות כגון עצם היה מאתגר. האתגר העיקרי טמון בחוסר היכולת לשמר RNA ומורפולוגיה של רקמות באיכות טובה בעת עיבוד דגימות הרקמה הקשה לחיתוך. לכן, מתוארת כאן שיטה לעיבוד דגימות רקמת עצם טריות שהושגו כדי ליצור ביעילות נתוני שעתוק מרחבי. השיטה מאפשרת דה-הסתיידות של הדגימות, תוך הענקת קטעי רקמה מוצלחים עם פרטים מורפולוגיים שהשתמרו תוך הימנעות מפירוק RNA. בנוסף, ניתנות הנחיות מפורטות לדגימות שהיו בעבר מוטמעות פרפין, ללא דה-מינרליזציה, כגון דגימות שנאספו מבנקי רקמות. באמצעות הנחיות אלה, מוצגים נתוני שעתוק מרחבי באיכות גבוהה המופקים מדגימות בנק רקמות של גידול ראשוני וגרורות ריאה של אוסטאוסרקומה בעצם.

Introduction

עצם היא רקמת חיבור מיוחדת המורכבת בעיקר מסיבים של קולגן מסוג 1 ומלחים אנאורגניים¹. כתוצאה מכך, העצם חזקה ונוקשה להפליא ובו בזמן קלה ועמידה בפני טראומה. כוחה הגדול של העצם נובע מתכולת המינרלים שלה. למעשה, עבור כל עלייה נתונה באחוז תכולת המינרלים, הנוקשות עולה פי חמישה². כתוצאה מכך, חוקרים נתקלים בבעיות משמעותיות כאשר הם מנתחים, באמצעות חתך היסטולוגי, את הביולוגיה של דגימת עצם.

היסטולוגיה של עצם לא מסוידת היא אפשרית ולפעמים נדרשת, בהתאם לסוג החקירה (למשל, כדי לחקור את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם); עם זאת, זה מאתגר מאוד, במיוחד אם הדגימות גדולות. במקרים אלה, עיבוד רקמות למטרות היסטולוגיות דורש מספר שינויים של פרוטוקולים סטנדרטיים וטכניקות³. באופן כללי, כדי לבצע הערכות היסטולוגיות נפוצות, רקמות העצם מסוידות מיד לאחר הקיבוע, תהליך שעשוי להימשך מספר ימים עד מספר שבועות, תלוי בגודל הרקמה ובחומר ההסתיידות המשמש⁴. חלקים מסוידים משמשים לעתים קרובות לבדיקת מח עצם, אבחון גידולים וכו ‘. ישנם שלושה סוגים עיקריים של חומרי הסתיידות: חומצות חזקות (למשל, חומצה חנקתית, חומצה הידרוכלורית), חומצות חלשות (למשל, חומצה פורמית), וחומרים כלאטיים (למשל, חומצה אתילאנדיאמיןטטרצטית או EDTA)⁵. חומצות חזקות יכולות לפרק את העצם במהירות רבה, אך הן עלולות לפגוע ברקמות; חומצות חלשות נפוצות מאוד ומתאימות להליכי אבחון; סוכני כלציה הם ללא ספק הנפוצים ביותר והמתאימים ביותר ליישום מחקרי, שכן במקרה זה, תהליך הדה-מינרליזציה הוא איטי ועדין, ומאפשר שמירה על מורפולוגיה באיכות גבוהה ושימור מידע על גנים וחלבונים, כפי שנדרש על ידי הליכים רבים (למשל, הכלאה באתר , immunostaining). עם זאת, כאשר כל התעתיק צריך להישמר, כגון עבור ניתוח ביטוי גנים, אפילו דה-מינרליזציה איטית ועדינה עלולה להזיק. לכן, יש צורך בגישות ושיטות טובות יותר כאשר הניתוח המורפולוגי של הרקמות צריך להיות משולב עם ניתוחי ביטוי גנים של התאים.

הודות לשיפורים האחרונים בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) ובשעתוק מרחבי, ניתן כעת לחקור את ביטוי הגנים של דגימת רקמה גם כאשר נעשה שימוש בהטבעה של פרפין קיבוע פורמלין (FFPE) לאחסון דגימות הרקמה ^6,7,8. הזדמנות זו פתחה גישה למספר גדול יותר של דגימות, כגון אלה המאוחסנות בבנקי רקמות ברחבי העולם. אם רוצים להשתמש ב-scRNA-seq, שלמות ה-RNA היא הדרישה החשובה ביותר; עם זאת, במקרה של תעתיק מרחבי של דגימות FFPE, הן קטעי רקמה באיכות גבוהה והן RNA באיכות גבוהה נחוצים כדי לדמיין את ביטוי הגן בהקשר ההיסטולוגי של כל קטע רקמה. אמנם זה הושג בקלות עם רקמות רכות, אותו הדבר לא ניתן לומר עבור רקמות קשות כמו עצם. למעשה, למיטב ידיעתנו, מעולם לא בוצע מחקר באמצעות תעתיק מרחבי על דגימות עצם מסוג FFPE. הסיבה לכך היא היעדר פרוטוקולים שיכולים לעבד ביעילות רקמות עצם FFPE תוך שמירה על תכולת ה- RNA שלהם. כאן, שיטה לעבד ו decalcize דגימות רקמת עצם שהושגו טרי תוך הימנעות השפלה RNA מסופק הראשון. לאחר מכן, מתוך הכרה בצורך בניתוח תמלול של דגימות FFPE שנאספו בבנקי רקמות ברחבי העולם, מוצגות גם הנחיות שפותחו לטיפול נכון בדגימות FFPE של עצמות לא דה-מינרליות.

Protocol

כל ההליכים המתוארים להלן בבעלי חיים אושרו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה בבית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג. 1. שיטה להכנת בלוקים FFPE של דגימות רקמת עצם הדורשים דה-מינרליזציה הכנת ריאגנטים וחומריםהכינו EDTA 20% pH 8.0. עבור 1 L, להמיס 200 גרם של EDTA…

Representative Results

השיטה המוצגת כאן מתארת כיצד לעבד עצמות מבודדות טריות כדי לקבל דגימות FFPE נטולות מינרלים שניתן לחתוך בקלות באמצעות מיקרוטום תוך שמירה על שלמות הרנ”א (איור 1). השיטה יושמה בהצלחה על עצם הירך אך ניתן לעקוב אחריה עבור דגימות רקמת עצם אחרות בממדים דומים, או שניתן להתאים אותה לדגימ…

Discussion

כאן, ניתנת שיטה מפורטת להכנת בלוקים FFPE של עצמות מסוידות ושמירה על שלמות RNA לריצוף (כלומר, ריצוף הדור הבא (NGS)) או לטכניקות אחרות הקשורות ל- RNA (כלומר, הכלאה באתר , תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) וכו ‘).

השיטה משתמשת ב- EDTA כדי להסיר דגימות רקמת עצם; הדגירה של EDTA …

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.