骨組織の空間的トランスクリプトミクスを可能にする方法

Summary

ここでは、新たに得られた骨組織の脱灰と高品質なRNAの保存を可能にする方法について述べます。また、脱灰されていない骨のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを切片化して、新鮮な組織が利用できない、または採取できない場合に高品質の結果を得る方法も示されています。

Abstract

細胞と各組織内の細胞の位置との関係を理解することは、正常な発生と疾患の病理に関連する生物学的プロセスを明らかにするために重要です。空間的トランスクリプトミクスは、組織サンプル内のトランスクリプトーム全体の分析を可能にする強力な方法であり、細胞の遺伝子発現と細胞が存在する組織学的状況に関する情報を提供します。この方法は多くの軟組織に広く利用されていますが、骨などの硬組織の分析への応用は困難でした。主な課題は、切片化のために硬組織サンプルを処理しながら、高品質のRNAと組織の形態を保持できないことにあります。したがって、ここでは、新たに得られた骨組織サンプルを処理して空間的トランスクリプトミクスデータを効果的に生成する方法について説明する。この方法により、サンプルの脱灰が可能になり、RNAの分解を回避しながら、形態学的詳細が保存された組織切片が成功裏に得られます。さらに、組織バンクから採取したサンプルなど、以前に脱灰せずにパラフィン包埋したサンプルについて、詳細なガイドラインが提供されています。これらのガイドラインを使用して、骨骨肉腫の原発腫瘍および肺転移の組織バンクサンプルから生成された高品質の空間トランスクリプトミクスデータを示します。

Introduction

骨は、コラーゲン1型と無機塩¹の繊維を主成分とする特殊な結合組織です。その結果、骨は非常に強くて硬いと同時に、軽くて外傷に強いです。骨の大きな強度は、そのミネラル含有量に由来します。実際、ミネラル含有量の割合が増加すると、剛性は5倍に増加します²。その結果、研究者は、組織学的切片化によって骨標本の生物学を分析する際に重大な問題に直面します。

脱灰していない骨組織学は実行可能であり、調査の種類によっては必要になる場合があります(たとえば、骨の微細構造を研究するため)。ただし、特に標本が大きい場合は、非常に困難です。これらの場合、組織学的目的での組織処理には、標準的なプロトコルと技術のいくつかの修正が必要です³。一般に、一般的な組織学的評価を行うために、骨組織は固定直後に脱灰されますが、そのプロセスは、組織のサイズと利用される脱灰剤に応じて、数日から数週間かかる場合があります⁴。脱灰切片は、骨髄の検査、腫瘍の診断などによく使用されます。脱灰剤には、主に強酸(硝酸、塩酸など)、弱酸(ギ酸など)、キレート剤(エチレンジアミンテトラセト酸(EDTA)など)^の3種類があります5。強酸は骨を非常に急速に脱灰することができますが、組織に損傷を与える可能性があります。弱酸は非常に一般的で、診断手順に適しています。キレート剤は、この場合、脱灰プロセスが遅く穏やかであるため、多くの手順( in situ ハイブリダイゼーション、免疫染色など)で必要とされる高品質の形態の保持と遺伝子およびタンパク質情報の保存を可能にするため、研究用途に最も使用され、適切です。しかし、遺伝子発現解析など、トランスクリプトーム全体を保存する必要がある場合、ゆっくりとした穏やかな脱灰であっても、有害となる可能性があります。したがって、組織の形態学的解析を細胞の遺伝子発現解析と組み合わせる必要がある場合には、より優れたアプローチと方法が必要です。

近年のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)および空間的トランスクリプトミクスの改良により、^{組織サンプルの保存}にホルマリン固定パラフィン包埋法(FFPE)を使用した場合でも、組織サンプルの遺伝子発現を研究することが可能になりました^6,7,8。この機会により、世界中の組織バンクに保存されているものなど、より多くのサンプルへのアクセスが可能になりました。scRNA-seqを使用する場合、RNAの完全性が最も重要な要件です。しかし、FFPEサンプルの空間的トランスクリプトミクスの場合、各組織切片の組織学的状況内で遺伝子発現を可視化するためには、高品質の組織切片と高品質のRNAの両方が必要です。これは軟組織では簡単に達成できますが、骨のような硬組織では同じことが言えません。実際、私たちの知る限りでは、空間トランスクリプトミクスを用いた研究は、FFPE骨サンプルに対して行われたことがありません。これは、FFPE骨組織のRNA含有量を維持しながら効果的に処理できるプロトコルがないためです。ここでは、RNAの分解を避けながら、新たに得られた骨組織サンプルを処理および脱灰する方法が最初に提供されます。次に、世界中の組織バンクで収集されたFFPEサンプルのトランスクリプトミクス分析の必要性を認識し、脱灰されていない骨のFFPEサンプルを適切に処理するためのガイドラインも提示されます。

Protocol

以下に説明するすべての動物手順は、ピッツバーグ大学歯科医学部の実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して承認されています。 1. 脱灰が必要な骨組織サンプルのFFPEブロックの作製方法 試薬および材料の調製EDTA 20% pH 8.0を調製します。1Lの場合、200gのEDTAを800mLの超純水に溶かし、水酸化ナトリウム10NでpHを8.0に調整し、最後に超純水?…

Representative Results

ここで紹介する方法では、新たに分離した骨を処理して、RNAの完全性を維持しながらミクロトームで簡単に切片化できる脱灰FFPEサンプルを取得する方法について説明します(図1)。この方法はマウスの大腿骨に採用され、成功を収めていますが、同様の寸法の他の骨組織サンプルにも適用できますし、すべてのパラメータ(タイミング、溶液の量など)を増やすことで、よ?…

Discussion

ここでは、脱灰した骨のFFPEブロックを調製し、シーケンシング(すなわち、次世代シーケンシング(NGS))または他のRNA関連技術(すなわち、 in situ ハイブリダイゼーション、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)など)のためにRNAの完全性を保持するための詳細な方法を提供します。

この方法では、EDTAを利用して骨組織サンプルを脱灰します。EDTAインキュベーシ?…

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.