Histologiebeelden met hoge parameters genereren en analyseren met histoflowcytometrie
Summary
Hier wordt een methode beschreven die kan worden gebruikt om vijf of meer fluorescerende parameters af te beelden door middel van immunofluorescerende microscopie. Er wordt een analysepijplijn geschetst voor het extraheren van afzonderlijke cellen uit deze beelden en het uitvoeren van analyse van één cel door middel van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën, die celsubsets in weefselsecties kunnen identificeren.
Abstract
Het gebruik van histologie om de diversiteit van immuuncellen te onderzoeken in weefselsecties zoals die afkomstig zijn van het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt kritisch beperkt door het aantal fluorescerende parameters dat op één moment kan worden afgebeeld. De meeste subsets van immuuncellen zijn gedefinieerd met behulp van flowcytometrie met behulp van complexe combinaties van eiwitmarkers, waarvoor vaak vier of meer parameters nodig zijn om definitief te identificeren, wat de mogelijkheden van de meeste conventionele microscopen te boven gaat. Omdat flowcytometrie weefsels dissocieert en ruimtelijke informatie verliest, is er behoefte aan technieken die ruimtelijke informatie kunnen behouden terwijl de rollen van complexe celtypen worden ondervraagd. Deze problemen worden hier aangepakt door een methode te creëren voor het uitbreiden van het aantal fluorescerende parameters dat kan worden afgebeeld door de signalen van spectraal overlappende fluoroforen te verzamelen en spectrale ontmenging te gebruiken om de signalen van elke individuele fluorofoor te scheiden. Deze beelden worden vervolgens verwerkt met behulp van een analysepijplijn om histologiebeelden met hoge parameters te maken en afzonderlijke cellen uit deze beelden te extraheren, zodat de unieke fluorescerende eigenschappen van elke cel op celniveau kunnen worden geanalyseerd. Met behulp van flowcytometrie-achtige gating-strategieën kunnen cellen vervolgens worden geprofileerd in subsets en weer in kaart worden gebracht op de histologiesecties om niet alleen hun overvloed te kwantificeren, maar ook vast te stellen hoe ze interageren met de weefselomgeving. Over het algemeen wordt de eenvoud en het potentieel aangetoond van het gebruik van histoflowcytometrie om complexe immuunpopulaties in histologiesecties te bestuderen.
Introduction
Ontsteking veroorzaakt door cellen van het immuunsysteem en gliacellen kan bijdragen aan chronische aandoeningen van het CZS, waarbij elke populatie de activiteit van de anderekan bevorderen 1,2,3. Begrijpen hoe het immuunsysteem interageert met deze elementen van het CZS om CZS-ontsteking te bevorderen, is momenteel een belangrijk onderwerp van interesse en is enorm vergemakkelijkt door technieken met hoge parameters, zoals single-cell RNA-sequencing. Door middel van single-cell RNA-sequencing hebben we ontdekt dat er uitgebreide communicatie plaatsvindt tussen gliacellen en het immuunsysteem bij verschillende CZS-aandoeningen 4,5,6. Begrijpen hoe deze interacties deze aandoeningen beïnvloeden, zal cruciaal zijn om de biologie van deze ziekten op te helderen.
Een probleem met single-cell sequencing-analyses is dat deze technieken vereisen dat het weefsel wordt verstoord om enkele cellen of kernen te verkrijgen, wat resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke informatie. Weten waar een cel zich in een weefsel bevindt, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de rol van de cel bij het veroorzaken van ontstekingen. Immuuncellen zoals B-cellen kunnen zich bijvoorbeeld concentreren in het CZS tijdens neuro-inflammatie; ze komen echter zelden in het CZS-parenchym terecht en concentreren zich in plaats daarvan in CZS-barrières7. Gezien hun lokalisatie is het onwaarschijnlijk dat deze cellen bijdragen aan CZS-ontsteking door fysieke interactie met gliacellen in het CZS-parenchym, wat suggereert dat eventuele interacties die ze mogelijk hebben met gliacellen zouden plaatsvinden via uitgescheiden factoren. Bovendien heeft de pathologie die optreedt bij CZS-aandoeningen vaak structuur 8,9 zodat de lokalisatie van een cel in het weefsel kritisch kan bepalen of deze actief bijdraagt aan de aandoening of een omstander is. Het gebruik van ruimtelijke oriëntatie om de rol van een cel in de pathologie te evalueren is dus essentieel.
Het bestuderen van cellen in weefsel is meestal bereikt met behulp van immunohistochemie of immuunfluorescentiemicroscopie. Een probleem met deze technieken is dat ze doorgaans slechts maximaal vier parameters tegelijk kunnen weergeven. Dit is een belangrijke beperking van deze technieken, aangezien we weten uit flowcytometrie en single-cell RNA-sequencinganalyses dat veel celpopulaties twee of meer parameters nodig hebben voor hun identificatie; Ook neemt het aantal vereiste parameters doorgaans toe bij het zoeken naar specifieke subsets van een celtype10. Het is dus onpraktisch om standaard beeldvormingstechnieken te gebruiken om te bestuderen hoe subsets van cellen in een weefsel op elkaar kunnen inwerken.
Dit probleem is gedeeltelijk verholpen door nieuwere methoden met hoge parameters die ruimtelijke informatie kunnen behouden, zoals ruimtelijke RNA-sequencing11 en beeldvorming massacytometrie12. Hoewel deze technieken waardevol zijn, hebben ze verschillende problemen, zoals het feit dat ze niet algemeen beschikbaar zijn, driedimensionale gegevens in twee dimensies reduceren en aanzienlijke expertise vereisen om uit te voeren. Een andere techniek die bekend staat als sequentiële kleuring, waarbij weefsels worden gekleurd met een set antilichamen gevolgd door inactivering van de vorige set antilichamen voordat ze worden gekleurd met een andere set antilichamen, kan histologie met hoge parameters bereiken zonder dat er gespecialiseerde apparatuur of expertise nodig is 13,14,15. Sequentiële kleuring kan echter extreem arbeidsintensief zijn en vereist een grote hoeveelheid microscopietijd, wat onpraktisch kan zijn voor laboratoria die geen persoonlijke microscoop bezitten. Er is dus behoefte aan technieken die het aantal fluorescerende parameters kunnen uitbreiden dat in één keer kan worden afgebeeld op microscopen die algemeen en tijdig beschikbaar zijn.
Zodra de gegevens met hoge parameters zijn verkregen, doet zich een ander probleem voor: het is onwaarschijnlijk dat conventionele beeldanalysemethoden de gegevens met succes zullen analyseren. Technieken zoals handmatig tellen of drempelwaarden zijn alleen levensvatbaar als de analyse bestaat uit een enkele parameter of als meerdere markers dezelfde lokalisatie hebben waarbij alleen overlappende signalen worden geteld. Deze beperking maakt traditionele analyse ontoereikend om te werken met datasets met hoge parameters. Succesvolle analyse van deze datasets is bereikt door afzonderlijke cellen uit histologiebeelden te segmenteren en vervolgens flowcytometrie-achtige gatingstrategieën uit te voeren om celtypen te identificeren16,17. Een ander probleem dat van invloed is op deze analyses is echter dat ze alleen werken voor datasets waarin alle cellen van belang fysiek van elkaar zijn gescheiden, aangezien deze technieken geen methoden gebruiken die cellen die fysiek contact maken nauwkeurig kunnen scheiden. Er is dus een nieuwere methode nodig die analyses van één cel kan uitvoeren op histologiesecties, zelfs als de cellen fysiek contact hebben.
In dit artikel wordt een eenvoudig protocol beschreven, histoflowcytometrie genaamd, dat eerder is geïntroduceerd18 en dat het aantal fluorescerende parameters uitbreidt dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld met behulp van algemeen beschikbare microscopen. Dit protocol werkt door weefsels te kleuren met spectraal overlappende kleurstoffen en vervolgens spectrale compensatie te gebruiken om doorbloedingen van overlappende kanalen te verwijderen om heldere enkelvoudige vlekken te verkrijgen. Om de analyse van histologiebeelden met hoge parameters te vergemakkelijken, wordt een gedetailleerde analysepijplijn beschreven die afzonderlijke cellen uit weefselsecties extraheert met het oog op het sorteren van cellen in verschillende populaties met behulp van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën. Dit protocol werkt in weefsels waar cellen diffuus aanwezig zijn en in weefsels waar cellen dicht op elkaar zijn verdicht, waardoor deze techniek veelzijdig is voor de studie van weefsels zoals het CZS bij zowel homeostase als neuro-inflammatie. Histoflowcytometrie is daarom een nuttige techniek voor het bestuderen van interacties tussen complexe celtypen die meerdere celmarkers nodig hebben om cellen te definiëren met behoud van ruimtelijke informatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt het gebruik van histoflowcytometrie beschreven, een techniek die eerder is gevalideerd18. Het is aangetoond dat bij het kleuren van weefselsecties met spectraal overlappende kleurstoffen, die doorbloeding over kanalen kan worden verwijderd met behulp van spectrale compensatie, wat resulteert in een groter aantal fluorescerende parameters die duidelijk worden opgelost dan normaal mogelijk zou zijn met conventionele methoden. Omdat histologiebeelden met een hoge parameter moeilijk te anal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het Hotchkiss Brain Institute Advanced Microscopy Platform voor de beeldvormingsinfrastructuur en expertise. RWJ werd ondersteund door postdoctorale fellowship-financiering van het Eyes High-programma van de Universiteit van Calgary en door een onbeperkte educatieve fellowship van de Multiple Sclerosis Society of Canada en Roche Canada. VWY ontving salarisondersteuning van het Canada Research Chair Tier 1-programma. Dit werk werd ondersteund door operationele fondsen van de Canadian Institutes of Health Research Grant 1049959, de Multiple Sclerosis Society of Canada Grant 3236 en het Amerikaanse ministerie van Defensie van het door het Congres geleide Multiple Sclerosis Research Program. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De cijfers die in deze publicatie zijn aangepast, zijn oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott en V. Wee Yong. 2023. Analyse van één cel van histologiebeelden met hoge parameters met behulp van histoflowcytometrie. J. Immunol. 210: 2038-2049. Auteursrecht © [2023]. De Amerikaanse Vereniging van Immunologen, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
References
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
