Gerando e analisando imagens histológicas de alto parâmetro com citometria de histofluxo
Summary
Aqui está descrito um método que pode ser usado para obter imagens de cinco ou mais parâmetros fluorescentes por microscopia imunofluorescente. Um pipeline de análise para extrair células únicas dessas imagens e conduzir análises de células únicas por meio de estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo é delineado, o que pode identificar subconjuntos de células em seções de tecido.
Abstract
O uso da histologia para investigar a diversidade de células imunes em seções de tecido, como as derivadas do sistema nervoso central (SNC), é criticamente limitado pelo número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez. A maioria dos subconjuntos de células imunes foi definida usando citometria de fluxo usando combinações complexas de marcadores de proteínas, muitas vezes exigindo quatro ou mais parâmetros para serem identificados de forma conclusiva, o que está além das capacidades da maioria dos microscópios convencionais. Como a citometria de fluxo dissocia os tecidos e perde informações espaciais, há necessidade de técnicas que possam reter informações espaciais enquanto interrogam os papéis de tipos de células complexas. Essas questões são abordadas aqui criando um método para expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados coletando os sinais de fluoróforos espectralmente sobrepostos e usando a separação espectral para separar os sinais de cada fluoróforo individual. Essas imagens são então processadas usando um pipeline de análise para obter imagens histológicas de alto parâmetro e extrair células únicas dessas imagens para que as propriedades fluorescentes exclusivas de cada célula possam ser analisadas em um nível de célula única. Usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo, as células podem ser perfiladas em subconjuntos e mapeadas de volta para as seções de histologia para não apenas quantificar sua abundância, mas também estabelecer como elas interagem com o ambiente do tecido. No geral, a simplicidade e o potencial do uso da citometria de histofluxo para estudar populações imunes complexas em seções de histologia são demonstradas.
Introduction
A inflamação impulsionada por células do sistema imunológico e células gliais pode contribuir para distúrbios crônicos do SNC, onde cada população pode promover a atividade da outra 1,2,3. Compreender como o sistema imunológico interage com esses elementos do SNC para promover a inflamação do SNC é atualmente um grande tópico de interesse e tem sido muito facilitado por técnicas de alto parâmetro, como o sequenciamento de RNA de célula única. Por meio do sequenciamento de RNA de célula única, descobrimos que há uma extensa comunicação ocorrendo entre as células gliais e o sistema imunológico em vários distúrbios do SNC 4,5,6. Entender como essas interações estão afetando esses distúrbios será crucial para elucidar a biologia dessas doenças.
Um problema com as análises de sequenciamento de célula única é que essas técnicas exigem que o tecido seja interrompido para obter células ou núcleos únicos, resultando em uma perda completa de informações espaciais. Saber onde uma célula existe em um tecido é fundamental para entender o papel da célula na condução da inflamação. Por exemplo, células imunes, como células B, podem se concentrar no SNC durante a neuroinflamação; no entanto, raramente entram no parênquima do SNC e, em vez disso, concentram-se nas barreiras do SNC7. Dada a sua localização, é improvável que essas células contribuam para a inflamação do SNC interagindo fisicamente com as células gliais no parênquima do SNC, sugerindo que quaisquer interações que possam estar tendo com as células gliais ocorreriam por meio de fatores secretados. Além disso, a patologia que ocorre nos distúrbios do SNC geralmente tem estrutura 8,9 de modo que a localização de uma célula no tecido pode determinar criticamente se ela está contribuindo ativamente para o distúrbio ou se é um espectador. Assim, o uso da orientação espacial para avaliar o papel de uma célula na patologia é essencial.
O estudo de células no tecido geralmente é realizado usando imuno-histoquímica ou microscopia de imunofluorescência. Um problema com essas técnicas é que elas normalmente só podem gerar imagens de até quatro parâmetros simultaneamente. Esta é uma grande limitação para essas técnicas, pois sabemos por citometria de fluxo e análises de sequenciamento de RNA de célula única que muitas populações de células requerem dois ou mais parâmetros para sua identificação; Além disso, o número de parâmetros necessários normalmente aumenta ao procurar subconjuntos específicos de um tipo de célula10. Assim, é impraticável usar técnicas de imagem padrão para estudar como subconjuntos de células podem estar interagindo dentro de um tecido.
Esse problema foi parcialmente superado por meio de métodos mais recentes de alto parâmetro que podem reter informações espaciais, como sequenciamento espacial de RNA11 e citometria de massa de imagem12. Embora essas técnicas sejam valiosas, elas têm vários problemas, como não estarem amplamente disponíveis, reduzir os dados tridimensionais em duas dimensões e exigir uma experiência considerável para serem executadas. Outra técnica conhecida como coloração sequencial, em que os tecidos são corados com um conjunto de anticorpos seguido pela inativação do conjunto anterior de anticorpos antes da coloração com outro conjunto de anticorpos, pode atingir histologia de alto parâmetro sem a necessidade de equipamento especializado ou experiência 13,14,15. No entanto, a coloração sequencial pode ser extremamente trabalhosa e requer uma grande quantidade de tempo de microscopia, o que pode ser impraticável para laboratórios que não possuem um microscópio pessoal. Assim, há uma necessidade de técnicas que possam expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez em microscópios amplamente disponíveis e em tempo hábil.
Uma vez que os dados de alto parâmetro tenham sido adquiridos, surge outro problema: é improvável que os métodos convencionais de análise de imagem analisem os dados com sucesso. Técnicas como contagem manual ou limiar só são viáveis se a análise consistir em um único parâmetro ou se vários marcadores tiverem a mesma localização onde apenas sinais sobrepostos são contados. Essa limitação torna a análise tradicional inadequada para trabalhar com conjuntos de dados de alto parâmetro. A análise bem-sucedida desses conjuntos de dados foi alcançada segmentando células únicas de imagens histológicas e, em seguida, conduzindo estratégias de bloqueio semelhantes à citometria de fluxo para identificar tipos de células16,17. No entanto, outra questão que afeta essas análises é que elas funcionam apenas para conjuntos de dados em que todas as células de interesse estão fisicamente separadas umas das outras, pois essas técnicas não empregam métodos que possam separar com precisão as células que estão em contato físico. Assim, é necessário um método mais recente que possa realizar análises de células únicas em seções histológicas, mesmo que as células estejam em contato físico.
Neste artigo, é descrito um protocolo simples chamado citometria de histofluxo, que foi introduzido anteriormente18 , que expande o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados simultaneamente usando microscópios amplamente disponíveis. Este protocolo funciona colorindo tecidos com corantes espectralmente sobrepostos e, em seguida, usando compensação espectral para remover o sangramento de canais sobrepostos para obter manchas únicas claras. Para facilitar a análise de imagens histológicas de alto parâmetro, é descrito um pipeline de análise detalhado que extrai células únicas de seções de tecido com o objetivo de classificar células em populações distintas usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo. Este protocolo funciona em tecidos onde as células estão difusamente presentes e em tecidos onde as células estão compactadas, tornando esta técnica versátil para o estudo de tecidos como o SNC tanto na homeostase quanto na neuroinflamação. A citometria de histofluxo é, portanto, uma técnica útil para estudar interações entre tipos de células complexas que requerem vários marcadores celulares para definir as células, mantendo as informações espaciais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descreve-se aqui o uso da citometria de histofluxo, técnica validada anteriormente18. Está demonstrado que, ao corar seções de tecido com corantes espectralmente sobrepostos, esse sangramento através dos canais pode ser removido usando compensação espectral, resultando em um número maior de parâmetros fluorescentes sendo claramente resolvidos do que normalmente seria possível através de métodos convencionais. Como as imagens histológicas de alto parâmetro são difíceis de analisar u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Plataforma de Microscopia Avançada do Hotchkiss Brain Institute pela infraestrutura e experiência em imagens. A RWJ foi apoiada por financiamento de bolsas de pós-doutorado do programa Eyes High da Universidade de Calgary e por uma bolsa educacional irrestrita da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá e da Roche Canadá. A VWY recebeu apoio salarial do programa Canada Research Chair Tier 1. Este trabalho foi apoiado por fundos operacionais do Canadian Institutes of Health Research Grant 1049959, da Multiple Sclerosis Society of Canada Grant 3236 e do Departamento de Defesa dos EUA do Programa de Pesquisa de Esclerose Múltipla Dirigido pelo Congresso. A Figura 1 é criada com BioRender.com. Os números adaptados nesta publicação foram originalmente publicados no The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott e V. Wee Yong. 2023. Análise de célula única de imagens histológicas de alto parâmetro usando citometria de histofluxo. J. Imunol. 210: 2038-2049. Direitos autorais © [2023]. A Associação Americana de Imunologistas, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
References
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