Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device
Summary
We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.
Abstract
Terwijl de microfluïdische technologie is het bereiken van een nieuw niveau van volwassenheid voor macromoleculaire assays, cel-gebaseerde testen zijn nog in een prille stadium 1. Dit is grotendeels te wijten aan de moeilijkheid waarmee men kan een cel-compatibele en gestage micro-omgeving met behulp van conventionele microfabricage technieken en materialen te creëren. We pakken dit probleem aan door de invoering van een roman microfabricage materiaal, agarose gel, als het basismateriaal voor de microfluïdische apparaat. Agarose gel is zeer buigzaam, en doorlaatbaar voor gas en voedingsstoffen die nodig zijn voor de overleving van de cel, en dus een ideaal materiaal voor cel-gebaseerde testen. We hebben eerder al aangetoond dat agarose gel gebaseerde apparaten succesvol zijn geweest in het bestuderen van bacteriën en neutrofielen celmigratie 2. In dit rapport worden drie parallelle microfluïdische kanalen patroon in een agarosegel membraan van ongeveer 1mm dikte. Constante stromen met media / buffer worden onderhouden in de twee nevengeulen met behulp van een peristaltische pomp. Cellen zijn aangehouden in het centrum kanaal voor observatie. Omdat de voedingsstoffen en chemicaliën in de zijgeleiders voortdurend verspreiden van de kant tot het centrum kanaal, de chemische omgeving van het centrum kanaal is eenvoudig te bedienen via de stroming langs de zijkant kanalen. Met behulp van dit apparaat, tonen we aan dat de beweging van neurale stamcellen kan optisch worden gecontroleerd met gemak onder verschillende chemische omstandigheden, en de experimentele resultaten tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen verbetert. Beweeglijkheid van neurale stamcellen is een belangrijke biomarker voor de beoordeling van cellen agressiviteit, waardoor tumorigene factor 3. Het ontcijferen van het onderliggende mechanisme van NSC beweeglijkheid levert inzicht in beide stoornissen van neurale ontwikkeling en in de hersenen kankerstamcel invasie.
Protocol
Discussion
Fig. 1 toont trajecten van drie NSC stammen, de ouderlijke cellen, de wtEGFR en de ΔEGFR (controle). Elke set van trajecten werden verkregen uit een vijf uur lange film. Voor de ouderlijke cellen, celbeweeglijkheid bereikte een hoogtepunt toen EGF-concentratie werd ~ 10ng/ml, want wtEGFR cellen, celbeweeglijkheid piek verschoven naar 100ng/ml of hoger, voor ΔEGFR cellen, de cel beweeglijkheid was onafhankelijk van de EGF concentratie als verwacht.
De wtEGF cellen met 100ng/ml waren de meest beweeglijke cellen, verhuisden ze naar o…
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de New York State Office of Science, Technology en Wetenschappelijk Onderzoek (NYSTAR) (in de vorm van een Center for Advanced Technology subsidie), en door subsidies van de Nanobiotechnologie Center (NBTC), een STC-programma van de Nationale Science Foundation onder arbeidsovereenkomst nr. ECS-9876771, en de Amerikaanse hersentumor Association en de New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | FisherScientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
