הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג'ל מבוסס agarose Microfluidic
Summary
אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.
Abstract
בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג'ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג'ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג'ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו"ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג'ל agarose בעובי 1 מ"מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.
Protocol
Discussion
איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי. </p…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס 'ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג'ב).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | FisherScientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
