Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina
Summary
Proteínas se ligam à actina filamentosa (F-actina) através de módulos de actina de ligação distinto. Neste vídeo podemos demonstrar o procedimento de actina co-sedimentação, que é um ensaio in vitro rotineiramente usado para analisar proteínas ou domínios específicos que se ligam F-actina.
Abstract
O citoesqueleto de actina no interior da célula é uma rede de filamentos de actina que permite o movimento de células e processos celulares, e que gera tensão e ajuda a manter a forma celular. Embora o citoesqueleto de actina é uma estrutura rígida, é uma estrutura dinâmica que está em constante remodelação. Uma série de proteínas pode se ligar ao citoesqueleto de actina. A ligação de uma proteína particular para F-actina é muitas vezes desejada para suporte de células observações biológicas ou para entender melhor os processos dinâmicos, devido à remodelação do citoesqueleto de actina. O ensaio de actina co-sedimentação é um ensaio in vitro rotineiramente usados para analisar a ligação de proteínas específicas ou domínios de proteína com F-actina. Os princípios básicos do ensaio envolve um período de incubação da proteína de interesse (comprimento total ou de domínio de) com F-actina, passo ultracentrifugação para pellet F-actina e análise da proteína co-sedimentação com F-actina. Actina co-sedimentação ensaios podem ser desenvolvidos de acordo com medida afinidades de ligação de actina e ensaios na competição.
Protocol
Discussion
Actina co-sedimentação é um simples ensaio in vitro para analisar proteínas specfic ligação a F-actina. Neste vídeo, demonstramos um exemplo de como um simples actina co-sedimentação pode ser realizada. Vamos mostrar como preparar F-actina, prepare a proteína a ser testada e do procedimento de actina co-sedimentação. Um número de pontos devem ser considerados na realização de actina co-sedimentação ensaios. Por exemplo, os componentes do tampão para a incubação pode variar de acordo com a proteína a ser testada e pH, te…
Acknowledgements
Obrigado a Dr. Praveen Kumar no laboratório Wittman em UCSF para o filme de actina em células HaCAT.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
