Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.
Abstract
Usamos a técnica de célula inteira patch clamp para estudar os circuitos sinápticos que está por trás de processamento de informações visuais na retina. Neste vídeo, que irá guiá-lo através do processo de realização de célula inteira gravações de luz correntes evocados de células individuais na preparação fatia da retina. Usamos o tigre aquáticos salamandra como modelo animal. Começamos por descrever a dissecação do olho e mostrar como as fatias são montados para as gravações eletrofisiológicas. Uma vez que a fatia é colocada na câmara de gravação, que demonstram como executar de célula inteira gravações braçadeira de tensão. Em seguida, projeto de estímulos visuais sobre os fotorreceptores na fatia de obter luz evocou respostas atual. Durante a gravação que perfundir a fatia com agentes farmacológicos, no qual um sistema de perfusão de 8 canais nos permite alternar rapidamente entre diferentes agentes. A preparação fatia da retina é amplamente usado para gravações de patch clamp na retina, em particular para estudar ou células amácrinas bipolar, que não são acessíveis em uma preparação de todo o monte.
Protocol
Soluções Solução intracelular de células ganglionares (em mM): 100 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH Solução intracelular de células bipolares (em mM): 90 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH Solução de Ringer extracelular (em mM): 112 NaCl, Glicose 5, 5 …
Discussion
Benefícios:
Todos os tipos de células são acessíveis
A fácil identificação de tipos de células, em particular se um corante fluorescente é adicionado à solução do eletrodo
Agentes farmacológicos pode chegar facilmente a células-alvo
A técnica de patch clamp permite investigar o papel dos canais iônicos em cálculos diferentes da retina. A mesma informação não pode ser obtida através de gravações extracelluar espiga ou gravações com eletrodos afiada. <…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).